Plataformas integradas para triagem de ligantes de enzimas: do desenvolvimento à aplicação

Resumo

O crescente interesse pelo uso de abordagens que utilizam técnicas rápidas e eficientes de separação e de triagem na identificação de molécula ativas oriundas de extratos naturais e coleções combinatórias estimula o desenvolvimento de novos métodos e plataformas integradas de triagem que facilitem e reduzam o tempo empregado na identificação dessas substâncias. Com a proposta de desenvolver novos modelos de triagem de ligantes criando uma plataforma integrada, utilizando métodos on-line e off-line, nesse projeto, métodos de triagem por cromatografia de bioafinidade para avaliar a atividade biológica monitorando a modulação da atividade enzimática em ensaios de triagem de alta eficiência e por pesca "fishing" de ligantes serão desenvolvidos. Em modelos on-line o acoplamento das técnicas de separação cromatográfica com os ensaios biológicos, ou triagem de alta eficiência (high-resolution screening - HRS), envolve a inclusão de um ensaio enzimático eficiente ao final dessa separação e assim, detectar a atividade biológica diretamente no eluente do LC além de caracterizar quimicamente o(s) composto(s) biologicamente ativos on-line, reduzindo tempo e trabalho. Em abordagens at-line pode-se ainda incluir o nanofracionamento seguido de ensaios off-line. Em um modelo off-line de estudos de afinidade enzimas imobilizadas sobre partículas magnéticas (MBs) e/ou sepharose, são imersas diretamente na amostra. Moléculas com afinidade ficam retidas e são "pescadas" para futura identificação estrutural e de atividade biológica. Essas duas abordagens (afinidade e atividade) serão integradas permitindo avanços na busca por substâncias bioativas que poderão ser extrapoladas para qualquer alvo biológico de interesse. Entre os alvos de interesse destacam-se as colinesterases; Acetilcolinesterase (AChE) e Butirilcolinesterase, e a ácido aspártico-protease beta-secretase-1 (BACE1). As monoamina oxidases (MAO) e as serino-proteases denominadas calicreína (KLK), com especial interesse na KLK1, KLK-3, KLK-5, KLK-6 e KLK-8 humanas. (AU)