Validação e caracterização funcional das isoformas de HJURP (Holliday Junction Recognition Protein) em células de astrocitoma

Resumo

Nosso grupo demonstrou que a proteína HJURP apresenta níveis muito elevados nos astrocitomas e mostra forte correlação com o pior prognóstico dos pacientes. HJURP é amplamente caracterizada por recrutar a proteína CENP-A para os centrômeros e sabemos também, através dos resultados obtidos em projeto anterior, que ela está envolvida em reparo de DNA e resistência à radiação, além de conferir capacidade proliferativa a linhagens de astrocitoma. Até o momento, todas as funções descritas para essa proteína foram baseadas em estudos feitos a partir de HJURP-A, a isoforma canônica, porém, existem sequências depositadas no GenBank que indicam a existência de 3 variantes transcricionais (NM_018410.5, NM_001282962.1 e NM_001282963.1). Os transcritos variantes (HJURP-2 e -3) apresentam exon-skipping e codificam proteínas hipotéticas (HJURP-B e -C), que excluem sítios de fosforilação já validados para HJURP-A. Destacamos o sítio S123, que é predito como alvo de CK2 (casein kinase 2), uma enzima que atua no controle da sinalização e reparo de danos ao DNA. Recentemente, comprovamos experimentalmente a expressão dos três transcritos, e observamos expressão diferencial de cada variante transcricional na progressão dos astrocitomas e no tecido cerebral não tumoral. Além disso, o silenciamento de HJURP-1 não afetou a viabilidade de linhagens de GBM, como ocorre quando todas as variantes são silenciadas. Estes resultados indicam que HJURP-B e HJURP-C são, de fato, funcionais e podem compensar a falta da HJURP-A, ao menos parcialmente. Entretanto, certamente existem especificidades de regulação que permitem sua atividade em processos ou contextos celulares distintos, justificando sua produção de maneira controlada. Deste modo, propomos aqui caracterizar a função molecular dessas variantes, buscando entender os mecanismos associados à complexidade de funções já descritas para essa proteína. Inicialmente, produziremos células superexpressoras de HJURP-B ou HJURP-C, e prosseguiremos com uma série de ensaios que visam verificar o envolvimento das isoformas na manutenção da cromatina centromérica e estrutura global da cromatina, no controle da atividade proliferativa, sinalização de danos, execução de reparo, aquisição de radio-resistência, entre outros. Assim, pretendemos contribuir para o entendimento dos mecanismos pelos quais HJURP exerce uma gama complexa de funções, e para elucidar a relação da expressão diferencial das diferentes isoformas com a progressão dos astrocitomas, o que é especialmente relevante quando consideramos seu potencial como alvo terapêutico para câncer. (AU)