Investigação da citotoxicidade de análogos de timidina utilizados para monitoramento da replicação do DNA em tripanosomatídeos

Resumo

Os análogos da timidina (os mais comuns 5-Bromo-22-deoxyuridine - BrdU, and 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine - EdU) são amplamente utilizados para monitorar a replicação do DNA em células eucarióticas. No entanto, artigos recentes têm relatado certos níveis de citotoxicidade em células de mamíferos, o que poderia enviesar dados relacionados à capacidade de replicação das células analisadas. Em tripanossomatídeos (parasitos eucariotos unicelulares), até o momento, não há relatos de efeitos tóxicos relacionados ao uso de análogos da timidina. Assim, existem três possibilidades: BrdU e EdU não são tóxicos para esses parasitas em concentrações de trabalho padrão; BrdU e EdU são tóxicos em concentrações de trabalho padrão e nenhum grupo de pesquisa avaliou essa toxicidade; ou apenas um desses análogos é tóxico. Para descobrirmos qual destas possibilidades é a correta, pretendemos investigar neste projeto os possíveis efeitos citotóxicos de BrdU e EdU sobre Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei e Leishmania major. Resultados preliminares sugerem que o EdU (mas não BrdU) é tóxico em concentrações de trabalho para L. major. Considerando que a única diferença entre EdU e BrdU é a presença do grupo etinil no lugar do átomo de bromo na posição 5, esse resultado preliminar justifica o início de uma investigação mais profunda sobre a citotoxicidade do grupo etinil quando presente na molécula de DNA. Pretendemos tratar os referidos tripanossomatídeos com diferentes concentrações de BrdU e EdU (e dT - timidina, como controle) e avaliar suas curvas de crescimento, concomitantemente a ensaios de viabilidade celular. Além disso, investigaremos a presença de possíveis paradas do ciclo celular pela análise do conteúdo de DNA por citometria de fluxo. Também pretendemos investigar a presença de danos no DNA e resposta a danos no DNA (DDR) por meio de ensaios de imunofluorescência (IFA) usando ±-³H2A e usando o ensaio Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL). Vale ressaltar que um melhor entendimento dos mecanismos moleculares essenciais durante o ciclo de vida desses organismos (cerne deste projeto) pode contribuir para o desenvolvimento de estratégias específicas de combate às doenças causadas por esses parasitos.