Emergência da recombinação V(D)J nos locus TCRbeta e expressão gênica diferencial durante a ontogenia do timo

Resumo

Este projeto situa-se no campo da imunogenética molecular da recombinação V(D)J do locus do receptor de linfócitos T beta (TCRß) durante o desenvolvimento fetal de linhagens isogênicas de camundongos (Balb-c, C57BL/6 e CBA/J). O controle da recombinação V(D)J de TCRs nos timócitos em diferenciação é assunto atual de pesquisas. Mesmo com a descrição do papel essencial dos genes RAG-1 e RAG-2 atuando diretamente no mecanismo do rearranjo entre genes V e C, vários outros produtos de genes tais como o da interleucina-7 (IL-7), MHC e os próprios transcritos de TCRß têm sido relacionados com o rearranjo de TCR. Resultados anteriores do nosso Laboratório mostram que os genes RAG-1 e RAG-2 se expressam no timo fetal a partir do 13° dia de gestação nestas linhagens de camundongos. Entretanto, a emergência da recombinação V(D)J nos loci de TCRα e TCRß se mostrou diferente nestas três linhagens, mas não a expressão (RNAm) destes genes que se inicia no 14° dia de gestação em todas as linhagens. Surgem perguntas sobre o que controla o início da recombinação V(D)J. Quais seriam os fatores genéticos que atuariam além dos genes RAG no controle da recombinação? Nosso Laboratório já vem desenvolvendo trabalhos neste sentido, estudando diferentes linhagens isogênicas como modelo para testarmos o efeito das diferenças do background genético na emergência da recombinação de TCRs. Na primeira parte deste projeto, pretendemos avaliar a expressão temporal de alguns genes envolvidos no processo, tais como o próprio TCRß, RAG-1, RAG-2 e citosinas relacionando com a emergência da recombinação do locus TCRß. O locus TCRß foi escolhido pois a expressão de transcritos "germline" deste gene parece ter efeito sobre sua própria recombinação. As linhagens isogênicas de camundongos constituem um modelo interessante e viável para estudos comparativos da expressão gênica diferencial. Em nosso Laboratório, pretendemos ensaiar a expressão dos genes acima mencionados usando métodos clássicos de biologia molecular tais como RT-PCR e hibridação molecular. Além disto, faz parte dos nossos objetivos avaliarmos a expressão de uma "constelação" de genes durante a ontogenia do timo, analisar o padrão de transcrição de maneira geral. Para isto se faz necessário o uso de sondas complexas preparadas a partir de RNA (cDNAs) obtidos do timo da idade fetal em que se inicia a recombinação V(D)J. As sondas serão hibridadas a filtros de alta densidade com milhares de clones de cDNA de timo de camundongo adulto. Esta etapa pretendemos realizar no Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy (INSERM-CNRS de Marseille, France), Laboratório do Prof. Bertrand Jordan, com quem trabalhamos em cooperação. (AU)