Triagem de mutação nos genes IRF6, MSX1 e PAX9 em indivíduos com fissura de lábio e palato e agenesia dentária

Resumo

A fissura labiopalatina e a agenesia dentária são consideradas alterações do desenvolvimento embrionário. Esses fenótipos ocorrem em decorrência da interação de fatores genéticos e ambientais, caracterizando um padrão de herança multifatorial. Essa associação de fatores dificulta a identificação de genes específicos determinantes dessas anomalias. A descoberta de genes responsáveis por síndromes nas quais as fissuras labiopalatinas e agenesia dentária façam parte, possibilitou a identificação de genes candidatos a essas alterações nas formas não sindrômicas. Entre os genes candidatos a esses fenótipos destacam-se: IRF6, MSX1 e PAX9. A proposta deste projeto é investigar mutações ou polimorfismos nos genes IRF6, MSX1 e PAX9 em indivíduos com fissura de lábio e palato não sindrômica e agenesia dentária isoladamente e em associação e indivíduos sem nenhuma alteração bem como correlacionar as possíveis alterações nos genes com os fenótipos. Para tal, serão selecionados e convidados a fazer parte do estudo 120 sujeitos distribuídos em quatro grupos: Grupo 1 (30 indivíduos com fissura completa de lábio e palato unilateral não sindrômica e agenesia dentária) ; Grupo 2 (30 indivíduos somente com fissura completa de lábio e palato unilateral não sindrômica sem agenesia dentária); Grupo 3 (30 indivíduos somente com algum tipo de agenesia dentária) esse grupo será de voluntários selecionados entre os estudantes dos cursos de Odontologia e Fonoaudiologia da Faculdade de Odontologia de Bauru - USP e Grupo 4 (Controle) - 30 indivíduos sem nenhuma alteração, selecionados da mesma forma que o Grupo 3. Os indivíduos com fissura labiopalatina serão triados entre os pacientes regularmente matriculados no Hospital de Reabilitação de Anomalias Craniofaciais - USP Bauru, quando comparecerem para consultas de rotina. Na análise de agenesia dentária serão excluídas as agenesias de 3os. Molares e dentes na área da fenda. Serão incluído preferencialmente pacientes com agenesias de dentes permanentes contra-laterais a fenda ou pré-molares independente do arco. Essa agenesia deverá ser de pelo menos um dente e no máximo 4 dentes. A triagem dos sujeitos e a coleta de saliva será realizada sempre pela doutoranda. A todos os indivíduos selecionados e convidados a participar do estudo, será solicitada leitura e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Para análise será coletada a saliva total expectorada durante 5 minutos e pipetados 1.500 µL para congelamento a -20oC até a extração do DNA genômico que será realizada por meio kit de extração de DNA, seguindo as orientações do fabricante. Na análise molecular as triagens de mutação nos genes IRF6, MSX1 e PAX9 serão realizadas por meio da PCR e seqüenciamento direto da região codificadora (éxons 3-9 do IRF6; éxons 1-2 do MSX1 e éxons 1-4 do PAX9). Os produtos da PCR serão purificados por meio do protocolo para o ExoSAP, conforme recomendações do fabricante. Cerca de 25 ng do produto purificado serão utilizados para a reação de seqüenciamento no termociclador (30 ciclos). A precipitação dos produtos será realizada por meio do kit BigDye X Terminator Purification (Applied Biosystems), de acordo com o protocolo do fabricante. Em seguida o produto será submetido a leitura no Seqüenciador modelo ABI 3130XL da Applied Biosystems. Cada mutação identificada no seqüenciamento será confirmada repetindo-se a reação em um novo produto de PCR. Para descrição das mutações será utilizado o sistema de nomenclatura de den Dunnen & Antonarakis (2000) e a do site http://www.hgvs.org/mutnomen. Os polimorfismos encontrados serão pesquisados em bases online. As alterações não descritas e que não se enquadrarem no critério adotado para definir mutação patogênica serão consideradas mutações polimorfismos. Para avaliar o efeito potencial de uma mutação no genoma, na transcrição e/ou na tradução serão utilizados programas de computador específicos (http://www.genome.ucsc.edu; http://rulai.cshl.edu.). (AU)