Identificação das possíveis interações entre as maquinarias dos telômeros e a maquinaria de reparo a danos no DNA em Leishmania spp.

Resumo

Os telômeros são complexos formados por proteína e DNA que protegem as extremidades dos cromossomos lineares de eucariotos. Eles conferem estabilidade ao genoma e viabilidade celular, pois evitam fusões e degradações terminais. Os telômeros de Leishmania spp. são compostos por repetições conservadas do tipo TTAGGG e como na maioria dos eucariotos são mantidos pela ação da telomerase. As proteínas que interagem com o DNA telomérico são componentes cruciais que mantém a arquitetura telomérica e regulam a atividade da telomerase. Dentre estas proteínas encontram-se algumas das proteínas alvo deste estudo, a RPA-1 e a TRF que cumprem importantes papéis nas maquinarias de replicação, recombinação e reparo do DNA genômico. Em nosso laboratório, a LaRPA-1 foi identificada e caracterizada nos telômeros de Leishmania amazonensis por afinidade à simples-fita telomérica rica em G e por se associar e co-localizar e in vivo com os telômeros do parasita. Resultados recentes mostram que em alguns eucariotos a RPA pode funcionar também como um sensor de danos ao DNA telomérico. Seu papel é se ligar aos telômeros danificados e recrutar, para iniciar o reparo, proteínas como a recombinase RAD51. A proteína LaTRF foi identificada interagindo in vivo com os telômeros do parasita e também co-localizando com os terminais de cromossomo. A proteína homóloga de humanos interage com componentes da maquinaria de reparo a danos no DNA de forma ciclo-dependente. No presente trabalho, pretende-se identificar as possíveis interações entre as proteínas teloméricas de Leishmania (ex: LaRPA-1, LaTRF) e a maquinaria de reparo a danos no DNA. Para tal, os parasitas serão submetidos a tratamentos com diferentes agentes genotóxicos ex, fleomicina e peróxido de hidrogênio. Possíveis alterações no tamanho do DNA telomérico serão verificados por ensaios de Southern blot não denaturante. Alterações na expressão dos genes e das proteínas teloméricas, assim como das proteínas envolvidas com reparo a danos ao DNA, serão verificadas por RT-PCR e Western blotting, respectivamente. Ensaios de imunoprecipitação e imunofluorescência. indireta acoplada ao FISH serão realizados para se verificar possíveis interações entre as proteínas teloméricas e entre as proteínas teloméricas e da maquinaria de reparo e suas co-localizações subcelulares. Quando possível, as interações físicas entre as proteínas estudadas serão confirmadas por "pull-down" e co-imunoprecipitação seguidas de análise dos eluatos por espectrometria de massa. (AU)