Manipulação de vias inibitórias da indução de pluripotência visando o aumento de eficiência no processo de geração de iPSs

Resumo

Celulas-Tronco Embrionárias (CTE) são capazes de se auto-renovarem mantendo-se pluripotentes. Estas propriedades tornam estas células potenciais ferramentas na Medicina Regenerativa. Recentemente, a geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) pela reprogramação genética de células somáticas (atravéz dos genes Oct4, Sox2, c-Myc e Klf4), criou novas expectativas para a terapia celular. No entanto, além dos riscos genéticos associados a integração de vetores retrovirais ao genoma, este processo ocorre com uma eficiência extremamente baixa, impedindo seu uso rotineiro. Sabe-se que certas vias ligadas a caracteristicas específicas de CT pluripotentes (como a via WNT/Gsk3-²/²-Catenina) podem interferir no processo de indução das iPSs. Assim, a inibição (ou ativação) de algumas destas vias nas células submetidas ao processo de indução de pluripotência poderia resultar no aumento da eficiência de indução. A técnica do RNA de interferencia (RNAi) é uma ferramenta cuja especificidade permite avaliar diretamente diferentes componentes de uma dada via. Assim, este projeto tem como objetivo, avaliar a influência da via WNT/Gsk3²/²Catenina na eficiência de geração de iPSs. Para isso, utilizaremos a técnica do RNAi contra ²Catenina e Gsk3² para, respectivamente, inibir ou ativar a sinalização da via nos fibroblastos submetidos a indução pelo uso de vetores lentivirais. A eficiência obtida na indução destes fibroblastos, determinada com base no número de colônias com morfologia similar a CTE, será comparada à obtida com células transfectadas com RNAi inespecífico, a células não transfectadas, e também, a células tratadas com um inibidor farmacológico de Gsk3-². As colônias de iPSs serão caracterizadas pela expressão gênica utilizando PCR em tempo real. Com estes resultados, esperamos melhor compreender o processo de indução da pluripotência, além de avaliar o uso de uma abordagem inédita, a aplicação de RNAi. Finalmente, o aumento de eficiência neste processo, pode levar à expansão de seu uso, na pesquisa básica e clínica. (AU)