MiR-29a inibe dois componentes centrais da desmetilação ativa do DNA, Tet1 e Tdg: mecanismo potencial durante a reprogramação

Resumo

Células somáticas adultas podem ser reprogramadas em células de pluripotência induzida (iPSCs) através da expressão ectópica de fatores de transcrição (FT) relacionados à pluripotência, tais como: Oct4, Sox2, Nanog e cMyc. Os microRNAs (miRs) são RNAs não codificantesinvolvidos na regulação pos-transcricional de uma grande variedade de alvos, e por isso, pode influenciar no destino celular através de modulação de vias de sinalização e processos biológicos. Assim, miRs são considerados ferramentas promissoras para aumentar a eficiência de reprogramação. Foi demonstrado que, enquanto miR29a inibe a reprogramação, a sua depleção aumenta a eficiência de reprogramação em 2-3 vezes em MEFs (Mouse Embryonic Fibroblasts). Ademais, a transdução de cMyc foi capaz de diminuir os níveis de miR29a e consequentemente, regular diversas vias de sinalização, acelerando o processo de reprogramação. Em nossos estudos preliminares, encontramos alvos da demetilação ativa do DNA (Tet1 e TDG) como sendo alvos diretos de miR29a em fibroblastos BJ. É importante ressaltar que a transcrição de Tet1 é controlada por Oct4 e Sox2, e durante a reprogramação, Tet1 se liga a dinucleotídeos CpG presentes nos promotores de FT de pluripotência, hidroximetilando-os, tornando esta regiões ricas em 5hmC, e consequentemente demetilada e reativada. Com intuito de explorar os mecanismos moleculares regulados por miR29a durante a geração de IPSCs, objetivamos realizar experimentos de reprogramação, baseados na transfecção de pré e anti-miR29a para avaliar se, de um lado, a transfecção de anti-miR29a em MEFs OG2 é capaz de restaurar o efeito positivo durante a reprogramação; e de outro lado avaliar o efeito negativo do pré-miR29a no mesmo processo. Em seguida, pretendemos realizar experimentos adicionais para avaliar o efeito positivo do anti-miR29a sobre os alvos Tet1 e TDG. Esta análise poderá ser realizada por transfecção concomitante de anti-miR29a e siRNAs contra Tet1 e/ou TDG. Experimentos adicionais com vetores contendo a sequência de luciferase fusionadas à região 3'UTR de Tet1 e TDG poderá confirmar a especificidade de miR29a. Adicionalmente, poderemos avaliar os papéis de DNMT3a/b neste último experimento. Contudo, nossos resultados poderá ajudar a entender como miR29a endógeno de fibroblastos pode impedir a geração de IPSCs, alvejando Tet1 e TDG, e que sua inibição através do uso de anti-miR29a, pode favorecer o processo de reprogramação, através do acúmulo de Tet1 e TDG. Esses resultados irão contribuir para a compreensão de como os miRs modulam e direcionam o processo de reprogramação, e como miR29a modula a maquinaria epigenética envolvida neste processo. (AU)