Expressão heteróloga e caracterização antigênica da Plgp43 de Paracoccidioides lutzii

Resumo

A gp43 é o principal antígeno diagnóstico da paracoccidioidomicose (PCM), que é uma micose sistêmica causada pelo Paracoccidioides brasiliensis. Nosso laboratório dispõe de isoformas recombinantes solúveis da molécula produzidas em Pichia pastoris que são úteis em ensaios diagnósticos de indivíduos infectados com os grupos filogenéticos S1, PS2 e PS3 de P. brasiliensis. O grupo do Pb01-like foi considerado uma nova espécie, denominado P. lutzii. A Plgp43 ortóloga de P. lutzii conserva apenas 80% de identidade com a gp43, além de não apresentar suas principais características: um sítio de glicosilação, epítopo P10 de células T e um sítio de glucanase inativo. Isso pode ter consequências não só no diagnóstico, como na própria interação do fungo com o hospedeiro. O objetivo do projeto é a expressão heteróloga do gene da Plgp43 de Pb01 em bactéria e P. pastoris. A molécula recombinante será utilizada na produção de anticorpos policlonais de coelho; testes com anticorpos monoclonais e policlonais anti-gp43 serão realizado; um grande número de soros de pacientes com PCM da região sudeste e centro-oeste do Brasil serão analisados. Essas análises serão realizadas através de "immunoblot", mas também imunodifusão passiva e "dot blot", caso seja possível obter a proteína solúvel. A molécula recombinante solúvel purificada será comparada com as demais isoformas de gp43 através de dicroísmo circular e quanto à estabilidade por espectroscopia de fluorescência. Em paralelo, serão revisitadas as tentativas de expressão de isoformas de gp43r mutada no sítio de glicosilação utilizando cDNA já disponíveis no laboratório serão retomadas. Adicionalmente, será feita a expressão e purificação da isoforma gp43r3 em larga escala para ensaios visando cristalização e estudos multicêntricos de sua utilidade diagnóstica.