Papel de sítios de ligação do domínio extracelular e transmembranar do receptor B1 de cininas e receptor AT1 da angiotensina II: correlação estrutura-atividade

Resumo

Recentes estudos sobre a relação estrutura-atividade do receptor B1 (B1R) revelaram que alguns resíduos importantes para a ligação entre a des-Arg9-Bradicinina (DBK) e o B1R são homólogos aos resíduos que atuam na interação entre a angiotensina II e o receptor AT1 (AT1R). Além disso, como o B1R e AT1R tem os mesmos dois resíduos na região C-terminal (Pro7-Phe8) foi sugerido que ambos os receptores tem sitios de ligação cruciais no topo da hélices V e VI para a interação. Baseados nesses é nosso objetivo: identificar resíduos importantes na interação entre a DBK e o B1R através de ensaios de ligação entre diferentes análogos da DBK e receptores com mutações; determinar a expressão funcional desses mutantes transfectados em células CHO, determinando-se a produção de IP3 e variações na concentração intracelular de Ca2+ (Ca2+]i); investigar se a região N-terminal da DBK (Arg1) interage com o Asp301 (712) do B1R, o resíduo homologo a Asp281 do AT1R; se a Asn130 (325) do B1R, resíduo homólogo a Asn111 (325) do AT1R, interage com Phe5 da DBK, pela substituição da Asn130 (325) por Gly; avaliar o papel da segunda ponte dissulfeto (Cys25 (100)-Cys294 (650) do B1R pela obtenção do mutante contendo Cys25(100) substituído por Ser. Confirmando-se a hipótese de Arg1 do peptídeo ser importante para interagir com a Asp301 (712) da alça EC-3 do receptor, pretende-se também verificar o papel do guanido grupo nessa posição do peptídeo, utilizando-se o análogo [Lys1]DBK. Esses receptores serão marcados com GFP e utilizaremos a técnica de fluorescência para verificar a distribuição preferencial dos receptores: se os mesmos são expressos na superfície da membrana celular ou são retidos no reticulo endoplásmico. A hipótese que os receptores não foram transportados para a membrana, pela maturação defeituosa dos mutantes, será investigada usando a calnexina, marcador do reticulo. (AU)