Avaliação de quatro métodos de extração de DNA bovino e bacteriano para quantificação por PCR em tempo real

Resumo

O objetivo deste estudo é o de comparar os resultados de repetibilidade e rendimento de quatro metodologias para extração de DNA bacteriano de S. aureus presente em amostras de leite de vacas com mastite subclínica, com vistas à amplificação pela reação da polimerase em cadeia em tempo real. Serão utilizadas dez amostras compostas de leite para a espécie de S. aureus para utilização nas quatro metodologias: A) Protocolo descrito por Cremonesi et al. (2006); B) Protocolo de extração comercial de DNA (1); C) Protocolo de extração comercial de DNA (2); D) Fervura em água estéril descrita por Barea et al. (2004). Após o processamento das amostras de leite pelas 4 metodologias sob teste, em quadruplicata, os materiais extraídos serão submetidos à determinação de pureza (Relação A260/A280) e concentração (¼g/¼L) por espectrofotometria, e à quantificação dos genomas-alvo (S. aureus e bovino) pela reação de PCR em tempo real (Ct). Em seguida, os resultados obtidos de cada um dos tratamentos, para cada uma das variáveis avaliadas, serão submetidos à análise estatística descritiva para a determinação da média, desvio padrão e coeficiente de variação entre as quadruplicatas, e as médias de cada tratamento serão submetidas à análise de variância para testar a hipótese de igualdade entre as metodologias de extração para as variáveis em estudo. Com a realização deste estudo, espera-se determinar a metodologia de extração de ácidos nucleicos mais indicada para a amplificação de DNA genômico por PCR em tempo real, com repetibilidade adequada para utilização na rotina diagnóstica de mastite subclínica com a quantificação do patógeno e da célula somática bovina presentes na amostra de leite.