Desenvolvimento de um novo ensaio fenotípico baseado na região C2-V3 da gp120 do Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1 (HIV-1) para a determinação do tropismo viral

Resumo

A entrada do HIV-1 nas células hospedeiras é um processo complexo evolvendo as proteínas do envelope do HIV-1; gp120 e gp41, um receptor celular, CD4, e correceptores celulares, tanto CCR5 quanto CXCR4. Vários estudos têm associado diferentes regiões no gene env como determinantes do tropismo pelo correceptor. Porém, a região V3 da gp120 é a principal determinante da especificidade pelo correceptor. Novos medicamentos antirretrovirais direcionados contra diferentes mecanismos da entrada do HIV-1 foram recentemente aprovados. O Maraviroc é o único antagonista de CCR5 comercialmente disponível. Uma vez que a atividade antagonista do CCR5 tem sido apenas demonstrada em pacientes que exibem exclusivamente variantes R5, a determinação do tropismo viral tem sido amplamente recomendada antes da prescrição do antagonista de CCR5. Um novo ensaio fenotípico é aqui proposto baseado em 450pb da região C2-V3 da gp120 do envelope do HIV-1. Utilizando-se a técnica de mutagênese sítio dirigida, a região C2-V3 da gp120 do pNL4.3 será deletada para obter o vetor pNL4.3V3. Fragmentos de 750 pb serão amplificados de amostras de pacientes compreendendo a região C2-V3 deletada com aproximadamente 150 pb de extensão em ambos os lados para permitir a recombinação homóloga durante a transfecção. Amostras de pacientes amplificadas por PCR e pNL4.3V3 serão cotransfectadas em células T 293 para obter partículas virais recombinantes e então permitir infectar linhagens de células CD4.U373. MAGI expressando tanto CCR5 quanto CXCR4 para determiner tropismo. Este ensaio irá reduzir a região para determinação do tropismo fenotípico para 450 pb da região C2-V3 da gp120. O ensaio fenotípico TRT desenvolvido por Trouplin e colaboradores (2001) será também desenvolvido para validar nosso ensaio de tropismo. Regiões V3 de todos os pacientes também serão sequenciadas e algoritmos genotípicos serão utilizados para predizer o tropismo baseados em suas sequências. Resultados dos ensaios genotípicos e fenotípicos serão comparados a fim de correlacioná-los. (AU)