O papel da via PDE5/GMPc no metabolismo lipídico de oócitos bovinos.

Resumo

A produção in vitro (PIV) de embriões bovinos vem sendo aplicada comercialmente com sucesso, porém, um dos principais obstáculos para uma maior disseminação desta técnica é a sensibilidade dos embriões à criopreservação. A menor criotolerância é freqüentemente associada com a acumulação de lipídeos no citoplasma dos embriões oriundos da PIV. Em adipócitos os níveis intracelulares de AMPc e GMPc são importantes para a regulação da taxa de lipólise. A PDE5A é a enzima degradadora de GMPc e quando ativada, a lipólise é negativamente afetada. O GMPc, cujos níveis são regulados por enzimas de síntese (guanilato ciclase - GC) e degradação (PDE5), está presente em CCOs. Dessa maneira este trabalho busca investigar a relação da PDE5 com o metabolismo lipídico de oócitos bovinos maturados in vitro. Para isso, a atividade da PDE5 será avaliada através da mensuração dos níveis de GMPc em oócitos com 0,12 e 24 horas de maturação com diferentes concentrações do inibidor de PDE5 (0, 500nM, 1µM e 10µM de Sildenafil) e o teor de lipídeos dos diferentes tratamentos será determinado pela sonda fluorescente Nile Red. Oócitos gerados com menor e maior teor de lipídeos serão fecundados (D0) e cultivados até o D7, quando a produção será dividia em dois grupos: o primeiro será criopreservado e o segundo fixado para posteriormente ser submetido à coloração dos filamentos de actina (indicador do teor de lipídeos nos embriões). O grupo destinado à criopreservação será descongelado para avaliação da taxa de re-expansão e coloração dos filamentos de actina, para se comparar as características pós-congelação/descongelação. Por fim, será investigado se a criopreservação de embriões PIV é prejudicada pela presença de SFB no meio de cultura, por interferir na via do GMPc. CCOs serão cultivados em meio de maturação suplementados com diferentes concentrações de SFB (2% e 10%). O grupo controle será maturado em meio com 0,4% de BSA. O efeito do SFB será avaliado sobre a atividade da PDE5, através da mensuração do nível de GMPc em oócitos imaturos e após 12 e 24 horas de maturação, e sobre a abundância relativa dos transcritos dos componentes da via GMPc (GUCY1B3, PKG1 e PDE5A). Maior conhecimento sobre o controle do metabolismo lipídico em oócitos poderá ocasionar modificações na própria célula oocitária, para torná-la capaz de originar embriões mais criopreserváveis.