Desenvolvimento do processo de purificação da proteína a de superfície do pneumococo do clado 4 (PspA4Pro)

Resumo

A bactéria Streptococcus pneumoniae é comumente encontrada no trato respiratório superior do homem, colonizando a nasofaringe, é um importante agente causal de pneumonia, otite, sinusite, meningite e sepse. Todas as vacinas utilizadas atualmente para combater as doenças pneumocócicas têm como base o polissacarídeo capsular (PS), livre ou conjugado a uma proteína. Infelizmente, devido ao preço elevado, muitas vezes estas vacinas não estão disponíveis para as parcelas mais carentes da população. Ademais, as vacinas disponíveis no Brasil estão longe de cobrir todos os casos da doença pneumocócica invasiva no país. Uma forma de reduzir o custo da vacina e aumentar sua cobertura é conjugar PS de sorotipos prevalentes a proteínas do próprio pneumococo. Dentre as proteínas candidatas, a proteína A de superfície de pneumococo (PspA) tem se mostrado promissora em ensaios animais de proteção contra o desafio e é bastante conservada entre as cepas: de acordo com a sequência de aminoácidos foi classificada 3 famílias e os anticorpos gerados contra PspA de uma família reagem com outras PspA da mesma família de forma cruzada. Somado a isso, PspA das famílias 1 e 2 estão presentes em 95-99% das cepas de pneumococo circulantes na população. Uma das etapas mais importantes da produção de vacinas é a purificação dos seus componentes, que devem apresentar um grau de pureza elevado para atender aos requisitos dos órgãos reguladores. A purificação também representa uma parcela significativa do custo de produção de um bioproduto. Ela envolve uma série de passos independentes, baseados nas diferenças das propriedades físico-químicas do produto de interesse e das impurezas, tais como: localização na célula, hidrofobicidade, massa molecular, carga elétrica, etc., de forma a enriquecer progressivamente o produto e a eliminar os componentes indesejados. Desta forma, este trabalho objetiva desenvolver um processo de purificação para a proteína recombinante PspA da família 2, clado 4, contendo a região rica em prolina (PspA4pro), que mostrou reatividade cruzada tanto para família 2 como para algumas cepas da família 1. A PspA4pro foi obtida em cultivos de alta densidade de E. coli e não possui fusões que auxiliem na purificação, assim o desenvolvimento de um método para sua purificação representará um marco no desenvolvimento de bioprocessos para obtenção de produtos recombinantes.Os cultivos em biorreatores para produção da PspA4pro foram realizados pela equipe do LaDaBio, UFSCar, sob orientação da profa. Dra. Teresa Cristina Zangirolami, e as células armazenadas a -80°C até o uso. A extração será feita em homogenizador continuo de alta pressão (APV Gaulin) com controle da temperatura (~12°C). A clarificação será feita por centrifugação e o material clarificado será então submetido a etapas cromatográficas. Cromatografias de troca iônica, interação hidrofóbica e gel filtração serão testadas e diferentes sequências avaliadas de forma a maximizar o rendimento e a pureza do processo. A proteína purificada será então caracterizada: o peso molecular da PspA4pro será determinado por cromatografia de exclusão molecular de alta performance (HPSEC), espectros de dicroísmo circular serão utilizados para análise da estrutura secundária e Western Blotting para verificação do reconhecimento por anticorpos produzidos contra a proteína nativa. (AU)