Cultivo in vitro de células luteais bovinas esteroidogênicas e não esteroidogênicas. Efeito da PGF2± na expressão de genes e proteínas ligados à esteroidogênese e apoptose

Resumo

Este trabalho tem como objetivo avaliar o efeito da PGF2± sobre a expressão gênica e proteica de substâncias envolvidas na esteroidogênese (StAR), na produção intraluteal de PGF2± (PGTS, PTGFS, HPGD) na indução da apoptose (CASP-3, Bax, Bcl2) e genes do sistema imune que possuem expressão aumentada durante o processo de luteólise funcional e que estimulam a síntese intraluteal de prostaglandina (IL-8 e FAS) no cultivo de células do corpo lúteo. Para tanto serão realizado três experimentos. No Experimento 1 serão utilizados CLs advindos de abatedouros, os quais serão devidamente processados em laboratório e as células luteais esteroidogênicas cultivadas por 48 horas, a fim de se observar a ação da PGF2± in vitro desse tipo celular. Essas células receberão os seguintes tratamentos: Grupo Controle: 1,0mL de meio de cultivo base, que após as 48 horas de cultivo uma parte desse meio será trocado por 1,0 mL de meio de cultivo base, consecutivamente a cada 6 horas; Grupo PGF2±: 10-6M PGF2± (Sigma® P 0424; KORZEKWA et al., 2008) diluído em 1,0 mL de meio de cultivo base, que após 48 horas de cultivo, uma parte desse meio será trocado e adicionado novamente 10-6M PGF2± diluído em 1,0 mL de meio de cultivo base em um intervalo de 6 horas até que se complete 24 horas. As células cultivadas serão avaliadas morfologicamente pela coloração com Oil Red e Hematoxilina, expressão gênica (qRT-PCR) e proteica (Imunofluorescência) para STAR, , PTGS2, PTGFS, HPGD, IL-8, FAS, CASP-3, Bax, Bcl-2, e por fim será dosada a progesterona (P4) do meio de cultivo pela técnica de radioimunoensaio (RIA). No Experimento 2 será realizado o co-cultivo das células luteais esteroidogênicas (CLEs), células luteais endoteliais (CLEn) e células do sistema imune (CSI) a fim de se observar a ação da PGF2± nesses tipos celulares in vitro. As CLEs serão novamente cultivadas por 48 horas, passado esse período as CLEn e CSI, serão adicionadas e pré-incubadas por 2 horas (Co-cultivo), dando início aos mesmos tratamentos e avaliações realizadas no Experimento 1. O Experimento 3 tem como objetivo observar a ação da PGF2± in vitro com o tratamento com essa droga em diferentes momentos. Para isso os poços da placa de cultivo contendo os três tipos celulares (CLEs, CLEn, CSI) receberão 5 aplicações de PGF2±; ou 5 aplicações de meio de cultivo base; ou 5 aplicações de PGF2± (1º, 3º e 5º momento) e os demais momentos (2º e 4º) receberão apenas meio de cultivo base. As técnicas para avaliação morfológica, expressão gênica e proteica e dosagem de P4 serão idênticas ao Experimento 1. Os dados obtidos serão tabulados e testes estatísticos adequados serão realizados.