Efeito in vitro do plasma urêmico e do uso de probióticos sobre a função de barreira, apoptose e inflamação em enterócitos humanos

Resumo

O trato gastrintestinal funciona como uma barreira entre o meio externo e o meio interno do organismo. O revestimento epitelial do intestino forma uma barreira seletivamente permeável, permitindo a passagem de nutrientes, íons e água, e impedindo a entrada de patógenos. Além de formarem esta barreira seletivamente permeável, as células epiteliais do intestino expressam inúmeros receptores e mediadores pró-inflamatórios, que permitem que estas células se comuniquem com o sistema imune. Acredita-se que a exposição de determinados produtos microbianos no lúmen intestinal tenha um papel importante em limitar a inflamação local e por consequência contribuir com a homeostase colônica. A microbiota intestinal é formada por diversos microorganismos, com predominância de bactérias. E dentre os vários gêneros bacterianos que compõem a microbiota, há os que são benéficos ao hospedeiro, principalmente Bifidobacterium e Lactobacillus, assim como, os que podem ser prejudiciais. Estudos in vitro, com células epiteliais colônicas humanas, tem demonstrado que a administração de determinados probióticos são capazes de inibir a secreção de citocinas pró-inflamatórias e de reforçar a função de barreira destas células. Na Doença Renal Crônica (DRC) tem sido sugerido que alterações intestinais podem ter uma relação importante com o estado inflamatório e com a toxicidade urêmica apresentadas por pacientes com DRC. Estudos sugerem que a uremia pode prejudicar a função de barreira do epitélio intestinal, promovendo aumento da permeabilidade intestinal, o que permite a entrada de antígenos ou produtos pro-inflamatórios provenientes do lúmen, levando a ativação de macrófagos, linfócitos T, liberação de citocinas pró-inflamatórias e recrutamento de células inflamatórias circulantes, favorecendo o estado inflamatório. Além de alterações na permeabilidade intestinal, foram encontradas também alterações acentuadas na composição da microbiota intestinal de indivíduos com DRC em programa de hemodiálise quando comparados com indivíduos saudáveis. Estas alterações da microbiota intestinal podem ser, em parte, causa ou consequência da disfunção da barreira intestinal e de suas estruturas, e da inflamação associada. Objetivos: Avaliar o efeito in vitro do plasma urêmico sobre a resistência elétrica transepitelial, inflamação e morte celular de células epiteliais do intestino, e o efeito in vitro de um determinado probiótico sobre as células insultadas, ou seja, avaliar se o probiótico é capaz de amenizar danos celulares causados pelo plasma urêmico. Materiais e métodos: Serão coletadas amostras de sangue de 30 pacientes com DRC em hemodiálise (HD) e de 15 indivíduos saudáveis para formar um pool de plasma pré-diálise, pós-diálise e controle. As células T84 serão utilizadas para as diferentes situações de incubação, quando a resistência elétrica transepitelial (TER) ultrapassar 1.000 m&/ cm². O estudo de incubação será dividido em duas fases de incubação: 1ª fase: as condições de incubação serão soro bovino fetal, plasma saudável, plasma urêmico pré-diálise e plasma urêmico pós-diálise, o tempo de incubação em cada condição será determinado após realização de curva tempo-resposta; 2ª fase: as células serão incubadas em condições semelhantes às realizadas na 1ª fase e em seguida serão incubadas com o probiótico Lactobacillus rhamnosus GG ou Bifidobacterium breve Reuter, o tempo e a quantidade de probiótico para incubação com as células T84 serão determinados após realização de curva tempo dose-resposta. Após o período de incubação a TER será medida novamente e as células serão processadas para serem submetidas às seguintes análises: imunofluorescencia para claudina 1, ocludina 1, ZO-1 e NFk-B p65, expressão de TLR-4 e TLR-9, TNF e IL-6 intracelular, apoptose e produção de espécies reativas de oxigênio por citometria de fluxo e detecção de TNF e IL-6 no sobrenadante da cultura e de NFk-B (p65) no núcleo por ELISA. (AU)