Explorando a seletividade por íons metálicos no sítio ativo da enzima Superóxido Dismutase (SOD) usando mutagênese sítio dirigida

Resumo

Superoxido dismutases (SODs) são metaloenzimas, utilizadas como defesa contra danos oxidativos causados por Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) de organismos aeróbios, através da conversão do ânion superóxido em oxigênio molecular (O2) e peróxido de hidrogênio (H2O2). Superoxido dismutases de Fe e Mn tem sequências que são altamente conservadas, especialmente aqueles resíduos que se encontram ao redor do sítio ativo (incluindo todos os ligantes diretos do metal), e suas estruturas cristalográficas são sobreponíveis. Porém, com poucas exceções, cada enzima é específica por apenas um dos dois metais e se o metal no sítio ativo, for trocado (ferro por manganês ou vice versa) o resultado é uma enzima não funcional. Isso indica que estas proteínas possuem alta especificidade por metal cuja origem não pode ser explicada de forma trivial. Bachega e colaboradores fizeram uma análise de acoplamento estatístico (SCA, do Inglês Statistical Coupling Analysis) na família das Fe/MnSODs onde a análise mostrou que aminoácidos estatisticamente acoplados agruparam-se próximo ao núcleo responsável pela formação dos centros metálicos. O mais interessante era que os resíduos estatisticamente acoplados eram diferentes nos dois grupos de enzimas, sendo capaz então de distinguir enzimas específicas por Fe das específicas por Mn. Este resultado sugere que os resíduos identificados na análise SCA podem ser responsáveis pelo ajuste fino da especificidade por metal. O objetivo deste projeto de pesquisa é identificar os determinantes estruturais do ajuste fino da especificidade por metal de MnSOD e FeSOD. Inicialmente, pretende-se selecionar resíduos para mutagênese sitio-dirigida na MnSOD do organismo Trichoderma reesei (TrMnSOD). Em seguida, mutantes serão expressos, purificados e cristalizados. A estrutura tridimensional dos mutantes será resolvida por difração de raios-X e sua atividade enzimática determinada. A presença dos metais e informação sobre a sua vizinhança será obtida por ressonância paramagnética eletrônica. Nossa hipótese de trabalho é que a análise por SCA indicaria os aminoácidos candidatos para mutagênese sítio-dirigida com o intuito de desenhar novas SODs com características intermediárias de ligação a Mn/Fe, e até a possibilidade de interconversão de especificidade. Com isto pretendemos contribuir para a nossa compreensão sobre os detalhes estruturais do ajuste fino da especificidade. A proposta é de pesquisa básica e faz parte de um tema abrangente: a relação entre estrutura e função de proteínas. (AU)