Matriz extracelular de biofilmes de Candida albicans e Candida glabrata susceptíveis e resistentes ao fluconazol: Caracterização, ação de enzimas hidrolíticas e eficácia da associação das enzimas à Terapia Fotodinâmica.

Resumo

As infecções causadas por Candida spp. são frequentemente associadas a formação de biofilme, uma microestrutura complexa de células aderidas a uma superfície e incorporadas dentro de uma matriz extracelular (MEC). A resistência dos biofilmes de Candida spp. é multifatorial e associada a fatores como o efeito protetor da MEC do biofilme realizado pelas beta-glucanas, que se ligam ao fluconazol e à anfotericina B, impedindo a penetração das drogas no biofilme. Além do efeito protetor da MEC realizado pelas beta-glucanas, foi demonstrado que o DNA extracelular (eDNA) também contribui para a integridade estrutural do biofilme. Estudos que avaliam a eficácia da PDT sugerem que a terapia é efetiva e promove completa inativação dos micro-organismos em suspensão, entretanto, a completa inativação dos mesmos organizados em biofilmes ainda não foi observada. Provavelmente, isso ocorre devido ao efeito protetor da MEC do biofilme, que dificulta a ação do agente fotossensibilizador. Outro aspecto importante é que as espécies resistentes a antifúngicos também têm sem mostrado mais resistentes à PDT. Sendo assim, inicialmente este projeto visa realizar a avaliação comparativa da MEC dos biofilmes de cepas de Candida albicans e Candida glabrata susceptíveis e resistentes à fluconazol através de contagem de colônias, análise do peso seco, quantificação de proteínas pelo método de Bradford, análise de polissacarídeos solúveis em água (WSP), análise de polissacarídeos solúveis em álcali (ASP) e análise de eDNA. A seguir, será determinada a melhor associação de enzimas hidrolíticas que possibilitariam a degradação de componentes da MEC destes biofilmes através de sua associação com as enzimas DNase, Dextranase ou beta-glucanase. A eficácia da utilização das enzimas será avaliada utilizando a mesma metodologia. Além disso, a estrutura dos biofilmes após os diferentes períodos de incubação com as enzimas será avaliada através de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e Microscopia Confocal a Laser. A partir desses resultados será verificado se a ação da terapia fotodinâmica mediada pelos fotossensibilizadores Curcumina e Photodithazine® seria ou não favorecida quando associada a estas enzimas. Para tal, serão realizados os seguintes testes: contagem de colônias, análise do peso seco, quantificação de proteínas pelo método de Bradford, análise de polissacarídeos solúveis em água (WSP), análise de polissacarídeos solúveis em álcali (ASP), análise de eDNA, MEV e microscopia confocal a laser. Os dados encontrados serão submetidos às análises estatísticas mais adequadas para cada condição experimental.