Consequências funcionais de rearranjos no gene FBXL17, presentes em amostras de pacientes e linhagens celulares de câncer de mama, na atividade da E3 ubiquitina-ligase SCF(Fbxl17)

Resumo

Fbxl17 é uma das 69 proteínas do tipo F-box (Fbx) em humanos que interage com SKP1, Cullina e RBX para formar o complexo E3 ubiquitina-ligase denominado SCF(Fbxl17) que medeia ubiquitinação de seus substratos. As Fbxls possuem além do domínio F-box de interação com SKP1, o domínio LRR (Leucine Rich Repeat) de interação com seus substratos. Mutações no gene FBXL17 que geram truncamentos no domínio LRR foram encontradas em 135 de 1992 amostras de pacientes do projeto METABRIC (Molecular Taxonomy of Breast Cancer International Consortium). Além disso, CGH-array (Comparative Genomic Hybridization) de 746 linhagens de células cancerosas mostrou que FBXL17 apresentou quebra em 3 linhagens de câncer de mama, BT-474, HCC38 e HCC1395 e 1 de câncer esofágico/gástrico OE-19 que levou a formação de versões de Fbxl17 com truncamentos no seu domínio LRR. Não há nenhum trabalho que relaciona Fbxl17 com tumorigenicidade e pretendemos nesse projeto identificar os substratos da E3 ligase SCF(Fbxl17) e avaliar quais deles tem sua ubiquitinação prejudicada em função da depleção do domínio LRR presente nas células tumorais. Para isso, utilizaremos os microarranjos de proteínas (protoarrays) como fonte de substratos e complexos SCF(Fbxl17) ou SCF(Fbxl17 mutantes) purificados de células de mamíferos em reações de ubiquitinação in vitro. Substratos diferencialmente ubiquitinados serão validados in vitro e in cellulo e realizaremos o mapeamento de cadeias de ubiquitina de cada um para inferirmos sofre a função da sua ubiquitinação por SCF(Fbxl17). Células expressando a forma mutante de Fbxl17-”3LRR (HCC1395, OE-19) e Fbxl17 (MCF7, HB4a) serão utilizadas para avaliação das consequências funcionais da ubiquitinação dos seus substratos identificados. Temos experiência comprovada para realização desses procedimentos e conto como colaboradores diretos o Prof. Dr. Marcelo D. Gomes do Depto. de Bioquímica e Imunologia da FMRP/USP e a Dra. Heike Laman e Dr. Paul Edwards do Department of Pathology da University of Cambridge/UK. A principal contribuição desse projeto é entender o papel da E3 ligase SCF(Fbxl17) e sua forma mutante SCF(Fbxl17-”3LRR) na tumorigenicidade de células de câncer de mama. Com isso, contribuiremos para definição de FBXL17 como um potencial biomarcador e alvo terapêutico para o câncer. (AU)