Efeito de mutações no gene AIRE (síndrome APS1) induzidas por CRISPR-Cas9 na conformação da proteína, no transcriptoma de células mTEC e na sua interação com timócitos

Resumo

O gene Autoimmune regulator (Aire) (cromossomo 21q22.3 humano e 10qC1 murino Mus musculus) é um controlador da tolerância imunológica central e do surgimento de doenças autoimunes. Aire apresenta ~80% de similaridade homem-camundongo e regula a transcrição de genes de autoantígenos de tecidos periféricos (PTAs do inglês peripheral tissue antigens) em células tímicas epiteliais medulares (mTECs do inglês medullary thymic epitelial cells). Esse fenômeno foi denominado de PGE (do inglês promiscuous gene expression.). O significado da PGE é imunológico, ou seja, a representação do próprio no timo, o que leva à seleção negativa de timócitos autoreativos. Já foram descritas mais de 100 mutações recessivas no gene Aire humano, muitas das quais estão associadas a manifestações da síndrome autoimune poli glandular do tipo 1 (APS1) (associação genótipo-fenótipo) (OMIM # 240300). A proteína Aire funciona em conjunto com vários "parceiros" (ex. DNA-PK, Sirt1 ...) na etapa de elongação da transcrição liberando a RNA Pol II ancorada às regiões promotoras de PTAs e de outros genes. Os genes controlados por Aire são referidos como Aire-dependentes. Recentemente, descobriram que o gene Fezf2 controla, no timo, a expressão de outro conjunto de genes de PTAs (Fezf2-dependentes). Nosso grupo trabalha com a expressão de Aire e PGE em células mTEC murinas e já evidenciamos que variações na expressão de Aire estão associadas a mudanças na PGE, no controle pós-transcricional de PTAs e no surgimento de diabetes autoimune do tipo 1 em camundongos NOD. Além disso, atribuímos duas "novas" funções ao gene Aire: 1) regulação da expressão de microRNAs (miRNAs) em mTECs e 2) controle da adesão mTECs-timócitos. Além disso, observamos algumas propriedades interessantes das mTECs: 1) quando essas células são cultivadas junto com timócitos (co-cultura como sistema modelo da adesão mTECs-timócitos), há aumento na expressão de Aire e também de CD80, MHC-II e Fezf2 e 2) a indução de mutação no exon 3 de Aire por meio do sistema CRISPR-Cas9 perturba o aparecimento da proteína Aire no núcleo das células mTEC e além disso, diminui a adesão dessas células com timócitos. Estes achados abriram perspectivas importantes para entendermos melhor a biologia das células mTEC e explorar pontos ainda elusivos. Por isso, formulamos as seguintes hipóteses: 1) a adesão mTECs-timócitos altera o transcriptoma das mTECs, incluindo os mRNAs e miRNAs e 2) mutações pontuais em Aire (variantes naturais), as mesmas encontradas em pacientes com APS1 (Aire domínio PHD no exon 7), podem alterar a conformação estrutural da proteína Aire. Tais alterações, principalmente as mutações missense, poderão ter um reflexo funcional nas células mTEC, por ex. alteração do transcriptoma e/ou da adesão mTECs-timócitos e/ou a migração de timócitos em direção às mTECs. Neste projeto, faremos uso de RNA-Seq e microarrays e dos sistemas modelo de adesão mTECs-timócitos (modelo murino) e de migração transwell timócitos a mTECs para testarmos essas hipóteses. A inovação tecnológica do projeto é a utilização do sistema CRISPR-Cas9 para indução de mutações "humanas" no gene Aire em células mTEC murinas. Selecionaremos clones de mTEC Aire mutantes para avaliarmos a expressão desse gene, a modulação do transcriptoma (mRNAs e miRNAs) por meio de RNA-Seq e/ou por microarrays. Com a modelagem in silico das proteínas Aire mutantes avaliaremos o efeito das mutações na relação estrutura-função. A inovação científica se dará em dois níveis: 1) a resposta transcricional (mRNAs e miRNAs) de mTECs quando essas aderem a timócitos e 2) como as mutações de Aire alteram a conformação da sua proteína e se estas alterações poderiam ser relacionadas, mesmo que indiretamente, com a adesão mTECs-timócitos, que é o ponto chave da seleção negativa, da tolerância imunológica central e da prevenção de doenças autoimunes. (AU)