Construção de cepas mutantes de Trichoderma reesei e análise de elementos regulatórios para identificar e caracterizar novos genes com potencial biotecnológico na degradação de lignocelulose

Resumo

No Brasil, bagaço de cana-de-açúcar tem sido proposto como um resíduo promissor para a produção de etanol de segunda geração (2G), devido a sua abundância e baixo custo. Entretanto, desafios biotecnológicos devem ser superados para que este combustível seja uma alternativa viável para os combustíveis fósseis. Neste contexto, é necessário reduzir o custo das enzimas utilizadas para desconstruir a lignocelulose e liberar açúcares fermentescíveis. O fungo Trichoderma reesei tem sido considerado um modelo para a degradação de celulose e suas enzimas já são utilizadas em vários coquetéis comerciais. Apesar de todo conhecimento adquirido, ainda não está completamente entendido como este fungo utiliza seu sistema celulolítico para descontruir a parede celular vegetal, nem os elementos regulatórios envolvidos neste processo. Recentemente, o transcriptoma de T. reesei RUT-C30 crescido em bagaço explodido de cana-de-açúcar foi investigado e vários genes diferencialmente expressos (DEGs) foram hiper-expressos nesta fonte de carbono, incluindo CAZymes, transportadores de açúcar, fatores de transcrição e genes não caracterizados que codificam proteínas com peptídeo sinal predito. A partir dos dados de RNA-Seq, uma análise de rede de co-expressão gênica foi realizada para identificar DEGs que foram co-expressos em bagaço e podem estar relacionados com a desconstrução da parede celular lignocelulósica. Em seguida, uma análise in silico foi conduzida para identificar motifs regulatórios de XYR1 e CRE1 na região promotora dos genes presentes na rede. Como parte do doutorado do estudante, cinco genes foram escolhidos para ser deletados ou superexpressos em T. reesei com o objetivo de elucidar suas funções na sacarificação da lignocelulose. Contudo, apesar de várias tentativas, o estudante não teve sucesso em transformar T. reesei. Esta técnica não se mostrou fácil de ser executada e seu êxito depende de vários fatores, como a cepa selecionada, protocolo e formação de protoplastos. Assim, um dos principais objetivos desta proposta é aprender e realizar a transformação de T. reesei no grupo de pesquisa da Dr. Astrid Mach-Aigner. Este grupo tem grande expertise em engenharia genética de T. reesei e tem contribuído ativamente para o conhecimento da biologia deste fungo, especialmente em relação à regulação transcricional de CAZymes durante a degradação de lignocelulose. Além disso, é proposto avaliar in vivo a influência do condensamento da cromatina na regulação de genes com motifs de XYR1/CRE1 preditos na região promotora nas condições de indução (celulose e lactose) e repressão (glicose), através de CHART-PCR. Esta metodologia é interessante para detectar a acessibilidade da cromatina e é realizada rotineiramente no grupo da Dr. Mach-Aigner. Ao final deste estágio, o conhecimento adquirido será útil para estudar novos genes potencialmente envolvidos na desconstrução da parede celular do bagaço. Os resultados encontrados podem ajudar a aumentar a eficiência dos coquetéis enzimáticos, melhorando as perspectivas para a viabilidade econômica do etanol 2G.