Isolamento de proteínas do loci de rDNA através da dCas9 marcada em células tumorais estimuladas com FGF2

Resumo

Apesar de ser um fator de crescimento, o FGF2 possui funções antiproliferativa e supressora de tumor em alguns contextos celulares. Na linhagem celular de adrenocarcinoma Y1, o FGF2 promove a transição G0-G1, mas atrasa a fase S e bloqueia permanentemente as células em G2/M. Para entender melhor a resposta da cromatina sob estímulos proliferativos e antiproliferativos induzidos, respectivamente, pelo soro bovino fetal (SFB) e FGF2, realizamos por proteômica quantitativa baseada em espectrometria de massas (Label-free) a análise das proteínas associadas à cromatina. Encontramos alterações na transcrição global (por ensaios de run-on), desorganização nucleolar (por imunofluorescência da fibrilarina e ensaios de microscopia eletrônica de transmissão), e pré-rRNA (por ensaios de Northern blot) após 1, 5 e 24 h após o tratamento com FGF2. O processamento e transcrição do rRNA são amplamente estudados, no entanto, devido a limitações técnicas, o conteúdo proteômico do locus de rDNA ainda não foi explorado. Aqui, propomos identificar as proteínas associadas a esses loci usando a técnica CLASP (Cas9 locus-associated proteome), uma tecnologia de ponta desenvolvida em colaboração com o grupo do Dr. Washburn. O conteúdo proteico identificado nos loci de rDNA será explorado no contexto do estímulo com FGF2 em uma linhagem celular de tumor de camundongo e em uma linhagem celular humana (Y1 e HEK293, respectivamente) expressando HRAS oncogênico induzível (HEK/ER:H-rasV12). Esses dados podem indicar mecanismos importantes mantidos no nucléolo pelo qual o FGF2 induz a parada do ciclo celular e também o proteoma inexplorado dos loci do rDNA, possivelmente identificando novos agentes da complexa biologia dos loci do nucléolo/rDNA. (AU)