Crispr Screen para identificar miRNAs associados com esfingosina quinase 2 e resposta a terapias em câncer oral

Resumo

O câncer oral é uma neoplasia maligna que pode acometer a cavidade oral e os lábios, sendo o carcinoma epidermóide oral (CEO) o subtipo mais comum. O CEO é altamente agressivo e frequentemente metastiza para linfonodos cervicais. Apesar dos avanços na terapia e do aumento no conhecimento sobre fatores associados ao CEO, a taxa de sobrevida para pacientes com CEO não melhorou substancialmente nos últimos anos. Desse modo, o estudo dos mecanismos associados ao desenvolvimento e à progressão do CEO ainda são necessários. A esfingosina quinase 2 (SK2) é uma das enzimas responsáveis pela formação de esfingolipídeos fosforilados, e vem sendo associada com tumorigênese. O papel de SK2 no câncer é discutível, pois parece ter efeitos opostos (supressor tumoral ou oncogênico) dependendo do nível de expressão e do contexto celular. Nosso grupo de pesquisa identificou que superexpressão de SK2 pode afetar diversos processos importantes no câncer. Por exemplo, induzir a transformação maligna de queratinócitos orais normais, aumentar o crescimento tumoral in vivo, e conferir características de células-tronco tumorais e resistência a agentes genotóxicos. Em adição, através de sequenciamento identificamos 133 microRNAs diferencialmente expressos na linhagem com superexpressão de SK2 (NOK-SK2), sendo que muitos desses miRNAs estão relacionados com a tumorigênese, como o miR-205-5p e mir-296-5p. Por meio de ensaios funcionais observamos que a inibição do miR-296-5p em células NOK-SK2 reduz a capacidade clonogênica e de formação de esferóides, e altera a expressão de proteínas envolvidas na transição epitélio-mesenquimal. Em conjunto, esses resultados sugerem que a desregulação desses mais de 100 miRNAs pode ter uma participação relevante no papel tumorigênico da superexpressão da SK2. Atualmente, uma técnica relevante para estudar genes essenciais para a tumorigênese é a triagem genética baseada em CRISPR (CRISPR screen). No sistema de CRISPR screen, são gerados pools de células com diversas modificações genômicas que podem ser rastreadas pelas sequências de sgRNA (RNAs de guia único) integradas ao DNA das células-alvo. No âmbito desse projeto, será realizado CRISPR screen com foco em microRNAs (1.594 alvos) em células (com e sem alteração de SK2) crescidas em cultura 3D e em modelo de xenoenxerto. As células com as modificações genômicas competiram umas com as outras com base na competência conferida pela deleção dos miRNAs. Possibilitando identificar nas células remanescentes após a pressão seletiva quais miRNAs cuja deleção tornou a célula mais ou menos apta ao crescimento em cultura 3D e in vivo. Dessa forma, esperamos que a triagem em larga escala de miRNAs gere resultados importantes com relação ao papel de miRNAs nos efeitos tumorigênicos da SK2 e, ainda, possibilite identificar miRNAs que possam ser explorados como alvos terapêuticos. Ademais, o uso de moduladores para os miRNAs identificados no CRISPR screen combinado com modulação de SK2 poderá resultar numa forma de terapia a ser explorada no futuro.