Análise do perfil de hipermetilação do gene PTEN e correlação com fatores clínicos e anatomopatológicos no carcinoma de células renais

• Processo: 09/14796-6
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Regular
• Data de Início da vigência: 01 de dezembro de 2009
• Data de Término da vigência: 30 de novembro de 2011
• Área do conhecimento: Ciências da Saúde - Medicina
• Pesquisador responsável: Ademar Lopes
• Beneficiário: Ademar Lopes
• Instituição Sede: Hospital A C Camargo. Fundação Antonio Prudente (FAP). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Oncologia Carcinoma
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: carcinoma de células renais | metilação | pirosequenciamento | Pten | oncologia

Resumo

Apesar da identificação de fatores prognósticos no Carcinoma De Células Renais (CCR), tumores com mesmo estadiamento, tratamento e subtipo histológico, apresentam evoluções distintas. Os procedimentos em biologia molecular têm procurado identificar novos fatores prognósticos capazes de melhor estratificar os pacientes quanto a uma maior ou menor risco de recorrência e submetê-los a tratamentos baseados em terapias de alvos moleculares. O PTEN (phosphatase with tensin homology deleted in chromosome 10) é um gene supressor tumoral que atua no controle da migração, proliferação e apoptose celular, podendo ser inativado por mutação, deleção ou hipermetilação em diferentes neoplasias sólidas. A metilação do DNA, corresponde a um evento epigenético em que ocorre a adição do radical metil (CH3) ao carbono 5 das bases nitrogenadas citosinas (C) localizadas a 5´das guaninas (G), através da ação de enzimas DNA metil-transferases. O radical metil ocupando a região promotora do gene impede a formação do transcrito primário, ocasionando seu silencionamento. A análise do perfil de hipermetilação de determinados genes, tem sido testada quanto à capacidade prognóstica mediante a correlação com fatores clínicos e anatomopatológicos além de alvo de terapias com o objetivo de reverter o fenótipo e normalizar o crescimento celular. Na análise do perfil de metilação do gene PTEN, deve-se considerar a existência de um pseudogene localizado no cromossomo 9p21 que apresenta 98% de mesma sequencia nucleotídica ao verdadeiro PTEN e que interfere na análise dos resultados. Para ZYSMAN et al. (2002), é importante a escolha correta do primer a ser utilizado na avaliação da metilação do PTEN para que não ocorram resultados falsos positivos mediante a correta diferenciação do verdadeiro com o pseudogene. A frequência de hipermetilação das ilhas CpG na região promotora do gene PTEN em CCR é desconhecida. Neste estudo, a pesquisa de metilação do PTEN será realizada através da técnica do pirosequenciamento. A técnica do pirosequenciamento é um método que analisa quantitativamente e em tempo real a incorporação de nucleotídeos mediante a conversão enzimática e liberação de pirofosfato através de detecção luminométrica. O segmento de DNA a ser analisado será extraído manualmente dos blocos de parafina de aproximadamente 200 casos e submetidos à PCR em tempo real com gene da beta actina para confirmar a qualidade da extração. Após a extração, o material será tratado com bisulfito de sódio, e nova PCR em tempo real será realizada para confirmar a integridade do material e tratamento completo com o bisulfito. Citosinas metiladas no DNA original permanecem não afetadas com o uso do bisulfito, enquanto que citosinas não metiladas são convertidas em uracil. Posteriormente o material será hibridizado com o primer para PTEN e então ocorrerá a pesquisa de metilação através do pirosequenciador e controle da reação com DNA humano para metilação. O uso do pirosequenciamento na pesquisa de metilação permite algumas vantagens em relação às outras técnicas: 1) controlar a qualidade da reação após o tratamento com bisulfito; 2) analisar sítios de metilação adjacentes ao sitio principal, identificando inclusive sequencias parcialmente metiladas; 3) confirmar a correta posição do primer na molécula de DNA modificada através da sequencia de nucleotídeos gerada ao redor do sítio de metilação. Os dados obtidos dos prontuários foram digitados e arquivados em um banco de dados com auxílio do programa "Excel 7.0 for Windows". Os dados serão atualizados quanto ao tempo de seguimento atual e acrescidos dos casos de neoplasia renal operados na instituição no período de 2005 a 2008, totalizando aproximadamente 200 casos. Na análise estatística será empregado o software Statistical Package for Social Science (SPSS) for Windows. (AU)