Recombinant expression and characterization of a cysteine peptidase from Xanthomonas citri subsp. citri

• Processo: 12/18021-1
• Modalidade de apoio: Auxílio à Pesquisa - Publicações científicas - Artigo
• Data de Início da vigência: 01 de outubro de 2012
• Data de Término da vigência: 31 de março de 2013
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Andrea Soares da Costa Fuentes
• Beneficiário: Andrea Soares da Costa Fuentes
• Instituição Sede: Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (CCBS). Universidade Federal de São Carlos (UFSCAR). São Carlos , SP, Brasil
• Assunto(s): Biotecnologia Xanthomonas Pichia pastoris
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cysteine peptidase | Pichia pastoris | Recombinant expression | Xanthomonas | Biotecnologia

Resumo

Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) é a bactéria responsável pela doença do cancro cítrico em plantas cítricas. O objetivo do presente estudo foi descrever a expressão recombinante, purificação e caracterização de uma cisteíno peptidase de Xanthomonas citri subsp. citri (estirpe 306), que é um candidato potencialmente envolvido na patogenicidade desta bactéria. O gene foi clonado e expresso em Pichia pastoris e a cisteíno peptidase foi expressa com sucesso, secretada e purificada por cromatografia de afinidade com rendimento de 10 mg / L. Um Anticorpo policlonal anti HISCPXAC reconheceu a cisteíno peptidase recombinante purificada HisCPXAC, confirmando a produção correcta desta proteína em Pichia pastoris. O mesmo anticorpo detectou a proteína no sobrenadante da cultura de Xanthomonas. citri. subsp. citri crescidas em meio indutor de patogenicidade. As análises cinéticas revelaram que a HISCPXAC foi capaz de hidrolisar o substrato carbobenzoxi-Leu-Arg-7-amido-4-metilcumarina (Z-Leu-Arg-MCA), com eficiência catalítica (kcat / Km) de 47 pM-1.s 1. A HisCPXAC purificada exibiu máxima atividade catalítica em pH 5,5 e temperatura de 30°C. A atividade da enzima recombinante foi inibida pelo inibidor específico de cisteíno peptidase (E-64), bem como inibidores de cisteíno peptidase recombinantes CaneCPI-1, CaneCPI-2, 3 e-CaneCPI CaneCPI-4, com valores de Ki de 1,214, 84,64, 0,088, 0,086 e 0,012 nM, respectivamente. Por último, a sequenciamento N-terminal da proteína purificada permitiu a identificação dos cinco primeiros resíduos de aminoácidos (AVHGM) imediatamente após o péptido de sinal putativo, permitindo assim a identificação do sítio de clivagem e confirmando estudos anteriores realizados por outros autores que identificaram esta sequência em uma proteína secretada a partir de Xanthomonas spp (AU)