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Identificação de diferentes modos de ligação do domínio N-terminal da Angiotensina II com receptores AT1 selvagem e mutantes

Processo: 07/01910-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Vigência (Início): 01 de setembro de 2007
Vigência (Término): 31 de agosto de 2009
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Farmacologia - Farmacologia Bioquímica e Molecular
Pesquisador responsável:Suma Imura Shimuta
Beneficiário:Renan Paulo Martin
Instituição-sede: Departamento de Biofísica. Escola Paulista de Medicina (EPM). Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Campus São Paulo. São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Receptores   Angiotensina II   Cálcio   Linhagem celular

Resumo

Verificou-se em estudo anterior que células CHO transfectadas com o receptor AT1 induziu taquifilaxia à [Lys2]-AII, efeito este atribuído à falta de regiões 3, 5-não traduzidas (3, 5-UTR) no cDNA para o receptor AT1. Além disso enquanto a taquifilaxia à AII era específica em linhagem de células de músculo liso arterial de coelho, que expressa o receptor AT1 endogeno, após co-transfecção com o gene para o receptor AT1 sem 3 ,5-UTR, as células se tornaram taquifiláticas para a [Lys2]-AII. Assim investigaremos se o receptor recombinante seria superexpresso ou se a taquifilaxia seria devida à predominância do receptor AT1 exógeno. Em outra abordagem sobre o receptor AT1, em recente estudo observou-se uma predominância na expressão do mutante do receptor AT1, C18S, na região perinuclear que na membrana plasmática das células CHO transfectadas com esse mutante. A hipótese de uma possível internalização constitutiva do mutante será investigada utilizando antagonistas específicos do receptor AT1. A tentativa de reversão será avaliada através de testes de ligação do receptor com o ligante na membrana, além da determinação de níveis de IP3 e de [Ca+2]i em células tratadas com os antagonistas do receptor AT1. Será testada a tecnologia de fluorescência polarizada em um leitor especifico de microplacas para medir a formação de IP3 e para a dosagem de [Ca+2]i com o fluo-3 como marcador do Ca2+, através de microscopia confocal. Em todos os testes serão utilizados além da AII outros análogos deste peptidio com substituição na região N-terminal ([Sar1]-AII, [Lys2]-AII e [Sar1Lys2]-AII). Outra hipótese que o receptor não foi convenientemente transportado para a membrana plasmática será investigada através de teste de colocalização com a calnexina, uma chaperona envolvida com a correta maturação de proteínas e transferência para a membrana. A detecção dessa calnexina será feita via fluorescência do anticorpo conjugado secundário anticoelho marcado com o fluoróforo Texas Red, utilizando-se microscópio confocal sem o tratamento e após tratamento com antagonista específico para a reversão da possível internalização.

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Publicações científicas
(Referências obtidas automaticamente do Web of Science e do SciELO, por meio da informação sobre o financiamento pela FAPESP e o número do processo correspondente, incluída na publicação pelos autores)
MARTIN, RENAN PAULO; RODRIGUES, ELIETE DA SILVA; ALVES CORREA, SILVANA APARECIDA; OLIVEIRA, SUZANA MACEDO; MORTARA, RENATO ARRUDA; OLIVEIRA, LAERTE; NAKAIE, CLOVIS RYUICHI; SHIMUTA, SUMA IMURA. Role of the second disulfide bridge (Cys(18)-Cys(274)) in stabilizing the inactive AT(1) receptor. Biological Chemistry, v. 391, n. 10, p. 1189-1195, OCT 2010. Citações Web of Science: 2.
MARTIN, RENAN P.; RODRIGUES, ELIETE S.; PACHECO, NELSON A. S.; CORREA, SILVANA A. A.; OLIVEIRA, SUZANA M.; OLIVEIRA, LAERTE; NAKAIE, CLOVIS R.; SHIMUTA, SUMA I. Distinct binding mode of I-125-AngII to AT(1) receptor without the Cys(18)-Cys(274) disulfide bridge. Regulatory Peptides, v. 158, n. 1-3, p. 14-18, NOV 27 2009. Citações Web of Science: 2.

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