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Determinação estrutural e funcional das enzimas Metiltioadenosina fosforilase e purina nucleosídeo fosforilase isoforma 2 de Schistossoma mansoni

Processo: 10/03420-2
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Vigência (Início): 01 de março de 2011
Vigência (Término): 31 de março de 2012
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Biofísica - Biofísica Molecular
Pesquisador responsável:Humberto D'Muniz Pereira
Beneficiário:Juliana Roberta Torini de Souza
Instituição-sede: Instituto de Física de São Carlos (IFSC). Universidade de São Paulo (USP). São Carlos , SP, Brasil
Assunto(s):Enzimologia   Cristalografia de proteínas   Cristalografia

Resumo

Causada pelo parasita Schistosoma mansoni, a esquistossomose mansoni também conhecida como barriga d'água ou doença do caramujo é uma doença parasitária crônica que afeta aproximadamente 200 milhões de pessoas no mundo sendo aproximadamente 6 milhões somente no Brasil. A esquistossomose é tratada através do uso de drogas que não são efetivas para a erradicação da doença, esses compostos apresentam alta eficiência, mas, no entanto causam graves efeitos colaterais. O parasita Schistosoma mansoni, não possui a via de síntese de bases púricas e depende integralmente da via de salvação para o seu requerimento de purinas, por este motivo tem sido levantada a hipótese da via de salvação ser um alvo interessante para o desenvolvimento de fármacos específicos para o combate da esquistossomose. No Projeto Genoma de Schistosoma mansoni diversas enzimas dessa via foram identificadas, entre elas duas isoformas da enzima PNP (E.C. 2.4.2.1) que possuem 61,8% de identidade entre si, esta enzima catalisa a fosforólise reversível de nucleosídeos de purina para gerar a base correspondente e ribose-1-fosfato utilizando como substrato a guanosina e a inosina, mas em algumas espécies essa enzima pode utilizar como substrato também a adenosina. O S. mansoni pode utilizar a adenosina como substrato alternativo, mas estudos recentes sobre a PNP1, juntamente com as descobertas feitas em 1975 por alguns pesquisadores, mostram que a reutilização do substrato adenosina em S. mansoni é realizada por uma enzima que difere da PNP1. Assim este projeto tem como objetivo a determinação das constantes catalíticas e da estrutura tridimensional da isoforma PNP2 e da MTAP (EC 2.4.2.28), enzima esta que tem como substrato a adenosina e a 5'-deoxi-5'-metiltioadenosina (MTA) sendo assim uma candidata junto com a PNP2 a ser a enzima responsável pela fosforólise da adenosina em S. mansoni. Para este propósito os genes que codificam para as enzimas descritas serão clonados em vetores de expressão, e a proteína será expressa em bactérias E. coli BL21(DE3) códon plus competentes, serão purificadas utilizando-se da técnica de cromatografia por afinidade. As proteínas serão submetidas a ensaios robóticos de cristalização visando à obtenção de cristais que serão submetidos à coleta de dados de difração na estação MX2 do laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS), em Campinas-SP. Já foram obtidos 2 conjuntos de dados para a MTAP sendo um a 2,3Å e 2,0Å de resolução. Para determinar a atividade enzimática das enzimas a serem estudadas, será utilizado como substrato, adenosina e inosina para a PNP2 e adenosina e MTA para MTAP. A determinação de constantes cinéticas e busca de inibidores, será através de procedimentos automatizados empregando o sistema robótico BIOMEK3000.

Publicações acadêmicas
(Referências obtidas automaticamente das Instituições de Ensino e Pesquisa do Estado de São Paulo)
SOUZA, Juliana Roberta Torini de. Determinação estrutural e funcional da enzima 5´-deoxi-5´-metiltioadenosina Fosforilase de Schistosoma mansoni. 2012. Dissertação de Mestrado - Universidade de São Paulo (USP). Instituto de Física de São Carlos São Carlos.

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