Estudo do papel de microRNAs nos efeitos biológicos de TGF-beta1 em fibroblastos de polpa dental humana

• Processo: 11/20303-2
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de agosto de 2012
• Data de Término da vigência: 31 de maio de 2013
• Área de conhecimento: Ciências da Saúde - Odontologia - Endodontia
• Pesquisador responsável: Sandra Helena Penha de Oliveira
• Beneficiário: Carla Renata Sipert
• Instituição Sede: Faculdade de Odontologia (FOA). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Araçatuba. Araçatuba , SP, Brasil
• Assunto(s): Matriz extracelular Fibroblastos MicroRNAs Biologia molecular
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Biologia molecular | fibroblastos | matriz extracelular | microRNA | Reparo da polpa dental | Biologia pulpar

Resumo

O tecido pulpar é persistentemente afetado por impactos ambientais durante a vida humana. A capacidade de reparo da polpa dental é limitada e os mecanismos envolvidos neste fenômeno não são completamente compreendidos. MicroRNAs são moléculas responsáveis pela regulação fina da síntese protéica e podem estar envolvidos no processo de reparo pulpar. Este estudo tem como objetivo investigar o papel de microRNAs no reparo da polpa dental. Cultura primária de fibroblastos de polpa dental humana serão estabelecidos a partir de terceiros molares hígidos (n=3). Os fibroblastos serão tratados com concentrações crescentes de TGF-b1 por 6, 24 e 72h para análise e validação da expressão dos microRNAs miR-144 e da família let-7. Com base nestes resultados, o silenciamento dos miRNAs expressos será realizado utilizando-se ácidos nucléicos estabilizados (Locked Nucleic Acid) e as células serão tratadas com TGF-b1 na concentração e tempo determinados anteriormente. A avaliação de alvos candidatos a interação com os microRNAs supracitados serão avaliados por RT-PCR (reação em cadeia da polimerase seguida de transcrição reversa) e a detecção das proteínas será realizada por Citometria de fluxo (Fibronectina, b8 integrina, b3 integrina, ±3 integrina e TGFBRI), Western blot (colágeno 1A1, 1A2, colágeno 3, fibrilina 1 e Smad4) e ELISA (trombospondina-1 e p-SMAD2/3). A marcação de diferenciação em miofibroblastos e odontoblastos-like será feita por imunofluorescência para actina de músculo liso e proteína de matriz dentinária 1. As células silenciadas e controle serão avaliados ainda quanto à proliferação e ciclo celular. Para avaliar a expressão de microRNAs durante o reparo da polpa dental, camundongos Balb/c serão tratados com um inibidor de TGFBRI (SB-431542) e submetidos à indução de exposição pulpar e capeamento direto com agregado trióxido mineral (MTA). Após 1, 2, 3 e 4 semanas, os animais serão eutanaziados e espécimes serão coletados para deteção dos microRNAs alvo por meio de hibridização in situ. Com base nos resultados dos ensaios in vitro e do ensaio de hibridização in situ, será realizado o silenciamento de miRNAs in vivo. Camundongos Balb/c serão tratados com inibidor de microRNA e submetidos à lesão pulpar como descrito anteriormente. Após quatro semanas, os animais serão eutanasiados e o reparo da polpa dental será avaliado histologicamente por coloração de hematoxilina e eosina.