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Expressão e purificação de cruzaína recombinante a partir de E. coli DH5a

Processo: 13/21102-6
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de janeiro de 2014
Vigência (Término): 30 de junho de 2014
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Farmácia
Pesquisador responsável:Carlota de Oliveira Rangel Yagui
Beneficiário:Gustavo Muneo Takata
Instituição-sede: Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Biotecnologia   Tripanossomíase   Purificação de proteínas   Fermentação   Cruzaína   Escherichia coli   Cromatografia líquida

Resumo

A tripanossomíase americana ou doença de Chagas é uma doença endêmica cujo agente causal, Trypanosoma cruzi, determina, nos seres humanos, quadros clínicos com características e consequências muito variadas. A cruzipaína é uma cisteína protease expressa em T. cruzi que demonstrou estar relacionada com a virulência e patogenicidade da doença e, portanto, se mostrou um potencial alvo terapêutico. Essa proteína conseguiu ser expressa sob a forma de proteína recombinante em E. coli DH5a, denominando-se cruzaína e apresentando o mesmo sítio de ação que a cruzipaína. Esse projeto visa aperfeiçoar a produção dessa enzima recombinante, determinando as melhores condições de cultivo da bactéria e de purificação da enzima. Para que a mesma possa então ser empregada em ensaios biológicos de compostos potencialmente antichagásicos (inibidores da cruzaína). Inicialmente, serão estudadas as condições de indução da expressão de cruzaína por E. coli (tempo e temperatura). Em seguida, será determinado o melhor protocolo de purificação por meio de cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC). Por fim, os parâmetros cinéticos (Km e Vmax) da cruzaína obtida serão determinados e comparados com os valores disponíveis na literatura.

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