Clonagem e estudo de expressão heteróloga de genes parceiros das glutamianses e das prolil hidroxilases 1 e 3

• Processo: 14/02187-3
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Programa Capacitação - Treinamento Técnico
• Data de Início da vigência: 01 de abril de 2014
• Data de Término da vigência: 30 de setembro de 2014
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
• Pesquisador responsável: Andre Luis Berteli Ambrosio
• Beneficiário: José Edwin Neciosup Quesñay
• Instituição Sede: Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM). Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação (Brasil). Campinas , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 12/14298-9 - Adaptação metabólica em câncer: estudos estruturais e funcionais de proteínas-chave nesse processo, AP.R
• Assunto(s): Biologia estrutural Neoplasias Metabolismo celular Células tumorais
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: câncer | Glutaminases | metabolismo | Prolil-hidroxilases | Biologia Estrutural

Resumo

Um dos objetivos fundamentais da pesquisa sobre câncer é o entendimento das mudanças moleculares que fazem com que células normais evoluam para tumores malignos. A adaptação das células cancerosas ao microambiente é o ponto central que leva ao fenótipo invasivo e metastático, e é garantida principalmente através do controle preciso da expressão gênica. A resposta às necessidades energéticas e biossintéticas e principalmente à disponibilidade de oxigênio intracelular, por exemplo, é em grande parte mediada pelo fator de transcrição induzido por hipóxia (HIF-1). HIF é um heterodímero composto pelas subunidades ± e ² (3 isoformas da subunidade ± já foram descritas), que respondem a sequência consenso (5´-RCGTG-3´) e ativam a transcrição de mais de 100 genes envolvidos em diversos aspectos cruciais da biologia tumoral, incluindo angiogênese, metabolismo de glicose, diferenciação celular, apoptose e resistência a rádio e quimioterapias. A estabilidade e a atividade transcricional de HIF são principalmente reguladas por modificações pós-traducionais (hidroxilações) catalizadas pelas enzimas prolil-hidroxilase (PHDs). PHDs são dioxigenases que usam 2-oxoglutarato como cofator e catalisam a hidroxilação dependente de Fe (II) e oxigênio de dois resíduos específicos de prolina. Sob condições de normóxia, hidroxilação de ODD (Pro-402 e Pro-564, em HIF-1) favorece a ligação do supressor de tumor VHL, levando HIF a poli-ubiquitinação e sinalizando para degradação proteossômica. Quatro isoformas das PHDs já foram descritas em humanos, sendo mostrada como tendo afinidades distintas ou atividade preferencial por cada uma das prolinas descritas acima, com distinçao também entre as isormas 1 e 2 de HIF. PHD2 é a prolil-hidroxilase mais estudada até então, principalmente do ponto de vista estrutural, porém PHDs 1 e 3 também possuem papeis importantes na regulação da estabilidade de HIF. Nesse sentido, o primeiro objetivo desse projeto é gerar construções das prolil-hidroxilases, isoformas 1 e 3, em vetores apropriados para expressão heteróloga e determinação de protocolos de purificação, explorando-se as diversas propriedades físico-químicas inerentes à cada uma das construções promissoras. A enzima glutaminase tem um papel essencial no metabolismo do aminoácido glutamina (e na anaplesores do ciclo do ácido tricarboxílico), mas além de seu domínio catalítico apresenta outros domínios ou motivos tipicamente envolvidos em contatos proteína-proteína. Diante destas evidências, este projeto tem como segundo objetivo clonar os genes previamente identificados no laboratório pela técnica do duplo-híbrido em levedura como parceiros das isoformas KGA, GAC e LGA. Além, pretende-se definir protocolos de expressão heteróloga e puficação. (AU)