Implementação da técnica de CLIP-seq e avaliação de mRNAs-alvo da proteína Caprin-1

• Processo: 14/20174-6
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Mestrado
• Data de Início da vigência: 01 de dezembro de 2014
• Data de Término da vigência: 29 de fevereiro de 2016
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Genética - Genética Humana e Médica
• Acordo de Cooperação: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
• Pesquisador responsável: Katlin Brauer Massirer
• Beneficiário: Natacha Azussa Migita
• Instituição Sede: Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG). Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 12/00195-3 - Redes de regulação pós-transcricional por proteínas de ligação a RNA em células tronco embrionárias humanas, AP.JP
• Assunto(s): RNA RNA mensageiro Imunoprecipitação Proteínas de ligação a RNA Fosfoproteínas Regulação da expressão gênica
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: CLIP-seq | mRNAs granulares | Proteína Caprin-1 | Proteínas de ligação a RNA | Regulação pós-transcricional | Rna

Resumo

Proteínas de ligação a RNA (RNA Binding Proteins - RBPs) regulam pós-transcricionalmente um vasto número de genes. Ligam-se a vários mRNAs celulares regulando splicing, localização, estabilização e degradação de transcritos e atuam como guias na regulação gênica por RNAs curtos não-codificantes, como microRNAs. Mutações nas RBPs ou alterações na regulação de mRNAs-alvo são associadas a estados patológicos e com falhas na manutenção da pluripotência de células-tronco e de processos envolvidos na diferenciação celular. No entanto, ainda não se conhece bem o mecanismo de atuação das RBPs nem seus mRNAs-alvo. Deste modo, o presente estudo visa identificar os mRNAs-alvo ligados a proteína Caprin-1 (ou Rng-105) além de definir os sítios de ligação da proteína aos mRNAs. A proteína Caprin-1 é uma fosfoproteína citoplasmática que possui domínio RGG, típico de RBPs. Essa proteína captura mRNAs em grânulos-complexos de alta densidade (grânulos de RNA), localizados no citoplasma de células para que possam ser rapidamente recrutados para a síntese proteica. É altamente expressa em tecidos neuronais e parece ter um papel importante na tradução localizada de mRNAs que são levados do corpo celular aos dendritos resultando em proteínas necessárias para o desenvolvimento dos mesmos e plasticidade sináptica. Para este estudo, será empregada a técnica de CLIP-seq (Crosslinking Immunoprecipitation of RBPs followed by RNA-seq), um método que começou a ser aplicado recentemente em larga escala no estudo bioquímico de interações proteína-mRNAs com a introdução de RNA-seq. Basicamente, o método consiste em realizar crosslinking por irradiação UV de células, imunoprecipitação do complexo proteína-mRNAs, fragmentação e seleção de mRNAs ligados a proteína, seguida de sequenciamento de nova geração. Os dados de CLIP-seq serão avaliados por ferramentas computacionais para identificar o conjunto de mRNAs-alvo e os prováveis sítios de ligação, definidos pelas regiões do transcriptoma com alta densidade de sequências. Será realizada a superexpressão da RBP de interesse em células HEK293 (Human Embryonic Kidney 293) para otimização da técnica de CLIP e validação dos alvos. Pretende-se desta forma, obter insights sobre a regulação de mRNAs em grânulos celulares e validar eventos regulatórios pós-transcricionais relacionados às RBPs. (AU)

Publicações acadêmicas

(Referências obtidas automaticamente das Instituições de Ensino e Pesquisa do Estado de São Paulo)

MIGITA, Natacha Azussa. Perfil de RNAs ligados a proteína Caprin-1. 2016. Dissertação de Mestrado - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia Campinas, SP.