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Avaliação in vitro da atividade inibitória de fitocistatinas sobre catepsinas e citocinas pró-inflamatórias expressas por macrófagos RAW 264.7 de camundongos após estímulo inflamatório

Processo: 15/18344-3
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
Vigência (Início): 01 de junho de 2016
Vigência (Término): 31 de dezembro de 2017
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Odontologia - Periodontia
Pesquisador responsável:Joni Augusto Cirelli
Beneficiário:Renata Cristina Lima Silva
Instituição-sede: Faculdade de Odontologia (FOAr). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus de Araraquara. Araraquara , SP, Brasil
Assunto(s):Periodontite   Mediadores da inflamação   Expressão gênica   Citocinas   Fitocistatinas   Macrófagos   Técnicas in vitro   Citotoxicidade   Reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR)

Resumo

A periodontite é uma doença infecciosa de caráter inflamatório que resulta na destruição dos tecidos de suporte dos dentes. Esta destruição é induzida em sua maior extensão pela resposta do hospedeiro frente à agressão causada pelo biofilme bacteriano. Durante a ação do hospedeiro, várias são as proteinases atuantes, entre elas as catepsinas B e K, que desempenham importante papel no início e na progressão da inflamação e que tem como inibidores as cistatinas. Estes inibidores produzidos de forma recombinante mostraram-se eficiente na inibição de catepsinas humanas, assim como outras cisteíno proteinases. O entendimento da participação das cisteíno proteinases na progressão da doença periodontal pode levar a novas terapias para o controle da doença periodontal. Sendo assim, o objetivo do presente estudo consiste em avaliar o efeito da atividade inibitória das fitocistatinas (Cane CPI-1 e Cane CPI-4 derivadas da cana de açúcar e a Citrus derivada da laranja) sobre as catepsinas B e K e citocinas pró-inflamatórias (IL-1², IL-6 e TNF-±) em células de linhagem macrofágica de camundongos (RAW 264.7) estimuladas com lipopolissacarídeo (LPS) de Escherichia coli (E. coli) e com a bactéria Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) inativada por calor. Para isso, será realizado um teste de tempo-resposta para avaliar a expressão gênica das catepsinas B e K e das citocinas pró-inflamatórias (IL-1², IL-6 e TNF-±) 6, 12 e 24 horas após estímulo, utilizando o RT-PCR em tempo real. Além disso, será realizado um teste para avaliar a citotoxicidade de diferentes concentrações das fitocistatinas sobre as células macrofágicas RAW 264.7 após 6, 12, 24 e 48 horas, utilizando o teste de citotoxicidade Alamar Blue. E, por fim, baseado nos experimentos anteriores, será escolhido o melhor estímulo inflamatório para se avaliar o efeito inibitório de concentrações não citotóxicas das fitocistatinas sobre a expressão gênica das catepsinas B e K e das citocinas pró-inflamatórias (IL-1², IL-6 e TNF-±) nas células macrofágicas RAW 264.7 após 6, 12 e 24 horas de estímulo, utilizando o RT-PCR em tempo real.

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