Nocaute do gene codificante para a enzima oxidase alternativa de M. perniciosa pelo sistema CRISPR-Cas9 e avaliação funcional das linhagens transformantes

• Processo: 17/13833-1
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de julho de 2017
• Data de Término da vigência: 30 de junho de 2018
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Genética - Genética Molecular e de Microorganismos
• Pesquisador responsável: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira
• Beneficiário: Lucas Leme Pinheiro
• Instituição Sede: Instituto de Biologia (IB). Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 16/10498-4 - Investigação das estratégias de adaptação ao estilo de vida patogênico de fungos do gênero Moniliophthora em diferentes níveis de organização biológica: espécies, biótipos e linhagens geográficas, AP.TEM
• Assunto(s): Manipulação genética Virulência CRISPR-Cas9 Sistemas CRISPR-Cas Moniliophthora perniciosa Oxidase alternativa
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Cas9 | Crispr | genes de patogenicidade | Interação planta-patógeno | manipulacao genetica | vassoura de bruxa | Genética de microrganismos

Resumo

A análise funcional de proteínas e vias metabólicas envolvidas na patogênese de M. perniciosa é fortemente limitada pela ausência de métodos eficientes para a manipulação genética do fungo. Apesar de avanços recentes para a transformação deste patógeno, dois desafios principais permanecem: a estabilidade da transformação e a baixa eficiência da deleção gênica por recombinação homóloga. O primeiro problema pode ser contornado mediante a transformação de células uninucleadas do fungo, tais como hifas monocarióticas ou esporos. O segundo problema é mais desafiador, sendo proposto o sistema CRISPR-Cas9 como possível solução, visto a grande quantidade atual de relatos bem-sucedidos em diferentes organismos. Brevemente, o sistema CRISPR-Cas depende de dois elementos: a endonuclease Cas9, com capacidade de edição genômica, e um RNA guia complementar à região de DNA que se pretende editar, conferindo a especificidade. A partir do trabalho de mestrado do aluno Gabriel Fiorin (FAPESP 2014/06181-0), o vetor para edição gênica de M. perniciosa foi construído (Tabela 1). Como alvo para de M. perniciosa, foi selecionado o gene da Oxidase Alternativa (mp-aox), potencialmente envolvido no estabelecimento da vassoura-de-bruxa, e para o qual já foram estabelecidos ensaios funcionais de atividade in vitro. O objetivo deste projeto é a transformação de M. perniciosa com o sistema proposto e a avaliação genotípica, fenotípica e de estabilidade das linhagens transformantes. (AU)