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Caracterização do envolvimento da proteína WNK2 no tráfego vesicular autofágico e endocítico em gliomas

Processo: 16/18907-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Mestrado
Vigência (Início): 01 de novembro de 2017
Vigência (Término): 31 de maio de 2019
Área do conhecimento:Ciências Biológicas - Genética - Genética Humana e Médica
Pesquisador responsável:Rui Manuel Vieira Reis
Beneficiário:Ana Laura Vieira Alves
Instituição-sede: Hospital do Câncer de Barretos. Fundação Pio XII (FP). Barretos , SP, Brasil
Assunto(s):Lisossomos   Endocitose   Biologia molecular   Glioblastoma   Autofagia

Resumo

O processo autofágico é um sistema de reciclagem e degradação, sugerido como uma importante via de morte celular em células tumorais. A via autofágica está interligada com as vias de endocitose a partir do mesmo destino final, lisossômico. Os lisossomos por sua vez são reguladores cruciais da homeostase celular, responsáveis por regular negativamente a sinalização de receptores e seu turnover, contribuindo para progressão tumoral. WNK2, um membro da subfamília WNK (With No Lysine (K)) são serina / treonina quinases, tem sido descrito ser regulado negativamente pela hipermetilação do seu promotor, e tem sido proposto atuar como um gene supressor específico em tumores cerebrais. Trabalhos do nosso grupo têm revelado que a inibição de WNK2 em gliomas está relacionado com a proliferação celular, migração, mortalidade e níveis de expressão de metaloproteínase-2. Além do mais, há evidências crescentes de funções adicionais das quinases WNK no tráfego vesicular. Resultados preliminares do nosso grupo sugerem que a restauração da proteína WNK2 em gliomas não interfere no processo de morte celular após o tratamento com o quimioterápico temozolamida, mas pode estar relacionada de alguma forma ao tráfego de vesículas, autofágico ou endocítico. Estudos descritos até o momento são contraditórios ao indicar WNK2 como um modulador de autofagia, sendo o seu papel na morte celular tumoral em grande parte, desconhecido. Neste contexto, dada a importância dos mecanismos autofágicos, endocíticos e lissomais na progressão tumoral e contraditória associação com a proteína WNK2, é de fundamental importância uma melhor caracterização dos mecanismos que norteiam esta proteína no contexto do câncer e, em especial em gliomas, tumores de elevada taxa de mortalidade e resistência inata às opções terapêuticas atuais. Este trabalho tem como objetivo portanto, caracterizar o papel da proteína WNK2 no tráfego vesicular autofágico, endocítico e lisossomal em linhagens de glioma. Para isso iremos: i) avaliar a expressão do gene que codifica WNK2 em um painel de linhagens comerciais e primárias de gliomas por Western-blot através da utilização de 3 anticorpos comerciais; ii) silenciar o gene WNK2 em uma linhagem comercial utilizando o vetor CRISPR; iii) validar o silenciamento e superexpressão de WNK2 por RT-PCR e Western-blot nas linhagens editadas e silenciadas; iv) identificar o perfil gênico das vias autofágicas, endocíticas e lisossomais associadas à WNK2 através de análise bioinformática utilizando a base de dados Oncomine; v) avaliar o processo de autofagia e as principais proteínas relacionadas a esta via utilizando as linhagens editadas e silenciadas para WNK2; vi) avaliar o processo de endocitose basal, e sua inibição nas linhagens transfectadas; vii) avaliar a presença de marcadores lisossomais nas linhagens editadas. Este trabalho permitirá portanto, um melhor entendimento do envolvimento da proteína WNK2 no tráfego vesicular e sua relação com a gliomagênese.