Análise dos mecanismos moleculares subjacentes à inibição do ciclo celular por FGF2 em células Y1 adrenocorticais e tumorais de camundongo, dependentes de WT-Kras amplificado

• Processo: 17/19545-8
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de novembro de 2017
• Data de Término da vigência: 29 de fevereiro de 2020
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Hugo Aguirre Armelin
• Beneficiário: Edmilson Ozorio dos Santos
• Instituição Sede: Instituto Butantan. São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 13/07467-1 - CeTICS - Centro de Toxinas, Imuno-Resposta e Sinalização Celular, AP.CEPID
• Assunto(s): Ciclo celular Oncogenes
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Amplificação do oncogene K-ras | Bloqueio do ciclo celular por FGF2 | Células malignas de camundongo | Controle do ciclo celular

Resumo

Mostramos anteriormente que as células tumorais Y1 exibem uma associação de traços fenotípicos surpreendentes, ou seja, altos níveis basais de K-Ras-GTP junto com bloqueio do ciclo celular por FGF2. Além disso, em células Y1, expressão ectópica de forma induzível do mutante dominante negativo Ras-N17 reduz os níveis basais de K-Ras-GTP e recupera a atividade mitogênica de FGF2 (Costa et al,2008; Salotti et al, 2011).Mais recentemente, em simulações computacionais com nosso modelo dinâmico de K-Ras fizemos a previsão de que células Y1 deveriam expressar pelo menos dois GEFs para catalisar a transição KRas-GDP à KRas-GTP, mantendo altos níveis basais de [K-Ras-GTP]. Esta previsão foi validada experimentalmente: primeiro, qRT-PCR mostrou que células Y1 expressam duas forma principais de GEF, SOS e RasGRP4. Segundo, sublinhagens clonais de Y1 selecionadas para resistência a FGF2 (Y!FRs), apresentaram: i) padrão normal de expressão dos FGFRs e dependência de FGF2 para proliferar; ii) baixíssimos níveis de expressão de K-Ras; iii) níveis negligenciáveis de RasGRP4-GEF (M. Reis et al, 2016). Terceiro, sublinhagens de Y1 nocauteadas para o gene K-ras, pela técnica de CRISPR-Cas9, exibiram em cultura fenótipo similar ao normal e não foram tumorigênicos em camundongos Nude M.Dias, C. Fonseca & H. Armelin, resultados não publicados). No conjunto, nossos resultados acima citados com células Y1 mostraram que a atividade oncogênica de K-Ras depende da concentração de K-Ras e da ação das Ras-GEFs SOS e GRP4. Além disso, resultados iniciais mostraram que estas conclusões também são válidas para células humanas experimentalmente transformadas por KRas e HRas oncogênicos (M. Dias, J. Zeidler, J. Galvão & H. Armelin, resultados não publicados).O objetivo geral deste projeto é estabelecer definitivamente os mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos tóxicos de FGF2 em células Y1. Por outro lado, seus objetivos específicos são.1.Quantificar a cinética de indução de KRas-GTP por FGF2 em células parentais Y1 e suas sublinhagens clonais Y1FRs e Y1-Kras-/-.2.Com a técnica de CRISPR-case9, nocautear os genes dos FGFRs, gerando um conjunto de 4 sublinhagens clonais de Y1, cada uma expressando somente um dos FGFRs e, também, uma sublinhagem Y1 FGFR-/- .3.Fazer uma triagem de genoma total com a técnica de CRISPR-case9 para identificar todos os genes essenciais para a atividade tóxica de FGF2 em células Y1.