Expressão heteróloga e caracterização funcional e estrutural da asparaginase RmASP1 de Rhodotorula mucilaginosa

• Processo: 17/27230-7
• Linha de fomento: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Vigência (Início): 01 de março de 2018
• Vigência (Término): 28 de fevereiro de 2019
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Microbiologia - Microbiologia Aplicada
• Pesquisador responsável: Marcos Antonio de Oliveira
• Beneficiário: Vitória Isabela Montanhero Cabrera
• Instituição-sede: Instituto de Biociências (IB-CLP). Universidade Estadual Paulista (UNESP). Campus Experimental do Litoral Paulista. São Vicente , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 13/08617-7 - Produção de L-asparaginase extracelular: da bioprospecção à engenharia de um biofármaco antileucêmico, AP.TEM
• Assunto(s): Biotecnologia Desenvolvimento de fármacos Biofármacos Rhodotorula Asparaginase Leucemia linfoide Clonagem Expressão de proteínas Purificação de enzimas

Resumo

As asparaginases (ASNases) de origem bacteriana oriundas de Eschericchia coli (EcA) e Erwinia chrysantemi (ErA) são importantes biofármacos utilizados no tratamento de leucemia linfóide aguda (LLA), uma neoplasia de células sanguíneas cujas as células tumorais são incapazes de sintetizar o aminoácido asparagina (Asn) e portanto necessitam para sua sobrevivência de Asn extracelular. As ASNases bacterianas são capazes de hidrolisar eficientemente a asparagina (Asn) em ácido aspártico (Asp) e amônia (NH3), diminuindo a disponibilidade de Asn para células tumorais, o que afeta a síntese proteica e de bases nitrogenadas e induz as células neoplásicas a apoptose. Apesar de aparentar ser uma alternativa, as isoformas humanas não podem ser utilizadas no tratamento da LLA uma vez que o Km reside na faixa de milimolar, enquanto que as enzimas bacterianas apresentam Km ~7.5 x 10-6 M. Comercialmente, indústrias farmacêuticas internacionais produzem ASNases de E. coli e E. chrysantemi, mas esse biofármaco não é produzido pelas indústrias farmacêuticas brasileiras, o que demonstra a fragilidade do Brasil na área de biofármacos. Adicionalmente, apesar de sua grande importância as ASNases bacterianas são capazes de estimular o sistema imune levando desde alergias leves até choques anafiláticos. Uma das possibilidades terapêuticas é a intercambialidade de EcA para ErA, respectivamente. Entretanto este procedimento não é possível no Brasil, pois somente a forma nativa de E. coli é aprovada pela ANVISA. De fato, mesmo com a troca do medicamento ainda existe uma parcela significativa dos pacientes que desenvolvem alergia aos medicamentos existentes e não podem efetuar o tratamento. Neste contexto, a busca por fontes alternativas desta enzima é de extrema importância para mitigar os efeitos imunológicos e também pode propiciar o desenvolvimento de um biofármaco nacional que poderá contribuir para a autossuficiência do Brasil. Estudos realizados no âmbito do projeto temático revelaram que um isolado oriundo da Antártica da levedura Rhodotorula mucilaginosa é capaz de produzir uma ASNase extracelular com alta eficiência catalítica. Em trabalho do nosso grupo de pesquisa envolvendo RNAseq identificamos um gene (rmasp1) cuja o produto proteico possui peptídeo sinal para exportação, apresenta identidade moderada com as enzimas bacterianas EcA e ErA (~ 60% de similaridade e ~ 40% identidade) e também possui todos os aminoácidos envolvidos na catálise conservados, o que pode representar uma nova alternativa para o tratamento da LLA. Os objetivos deste projeto residem na clonagem, expressão e purificação da enzima RmAsp1 e sua caracterização funcional e estrutural. Acreditamos que os resultados oriundos deste projeto são de grande importância para a valorização da biodiversidade e busca fortalecer de forma estratégica o estudo de biofármacos no Brasil (AU)