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Reprogramação metabólica e de função do macrófago por crotoxina

Processo: 18/09326-0
Linha de fomento:Bolsas no Brasil - Doutorado
Vigência (Início): 01 de março de 2019
Vigência (Término): 28 de fevereiro de 2021
Área do conhecimento:Ciências da Saúde - Medicina
Pesquisador responsável:Sandra Coccuzzo Sampaio Vessoni
Beneficiário:Patricia Pereira Nunes Traldi
Instituição-sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
Assunto(s):Biologia celular   Metabolismo   Macrófagos   Crotoxina

Resumo

Os macrófagos (MØ) são células com alta plasticidade que podem ser reprogramados em dois fenótipos distintos - MØ M1 (pró-inflamatórios) e MØ M2 (anti-inflamatórios) - de acordo com a natureza do distúrbio detectado no organismo. Experimentalmente, já é possível induzir a reprogramação de macrófagos a M1 e M2 e o estado funcional e metabólico de ambos os fenótipos já foram caracterizados. Estudos prévios de nosso grupo demostraram que a Crotoxina (CTX) exerce em macrófagos duas ações que os tornam aplicáveis em terapia celular: 1) altera seu perfil metabólico e funcional e 2) estes efeitos são de longa duração. Tais efeitos são observados após uma única e curta exposição à toxina. Neste contexto, esta pesquisa busca caracterizar o metabolismo e o estado funcional de MØ tratados com diferentes concentrações de CTX, com o objetivo de verificar se em cada concentração é possível identificar fenótipos distintos e intermediários aos perfis M1 e M2 já descritos, para assim buscar reprogramar essas células de acordo com processos fisiopatológicos específicos. A capacidade de reprogramação fenotípica de monócitos induzida pela CTX será avaliada em ensaios in vitro, onde células da linhagem monocítica humana (THP-1) serão incubadas na ausência (controle) ou presença de CTX em diferentes concentrações (2 nM; 10 nM; 50 nM e 100 nM) ao longo de 1 hora e então serão mantidas em cultura por 24 horas. Após os diferentes protocolos de incubação com a toxina, serão caracterizados os marcadores de fenótipos, por meio da técnica de qPCR, utilizando como marcadores do perfil M1 os receptores do tipo Toll (TLR-4), CD25 e CD80 e para o perfil M2, os marcadores para receptores manose, SR-A, CD163 e CD209. Como método de avaliação da função celular, serão analisadas a capacidade de espraiamento, fagocitose e secreção de citocinas (IL-1², IL-6, TNF-± e IL-10), geração de espécies reativas de oxigênio (H2O2) e nitrogênio (NO) pelos MØ. Considerando que os principais substratos do metabolismo de MØ são a glicose e a glutamina, para avaliar a função metabólica, serão analisadas a expressão gênica e atividade das enzimas chave da via glicolítica (hexoquinase, G6PDH e fosfofrutoquinase) e glutaminolítica (glutaminase). Serão avaliadas ainda a enzima-chave do ciclo do ácido cítrico (citrato sintase) e as enzimas ácido graxo sintase, ATP-citrato liase e enzima málica, envolvidas no metabolismo de ácidos graxos e a enzima chave da beta-oxidação - carnitina palmitoil-CoA transferase. Por fim, a concentração dos substratos citrato e succinato será mensurada. Este estudo, por meio da utilização da CTX como importante ferramenta científica capaz de modular o metabolismo de MØ, propiciará evidenciar pontos-chaves do metabolismo celular envolvidos na capacitação do sistema imunológico em controlar e/ou reverter a progressão de diferentes doenças inflamatórias, gerando importante impacto nos estudos de imunometabolismo e imunomodulação.