Avaliação por hibridização in situ quantitativa dos níveis dos transcritos de natterina-like em zebrafish depletados com CRISPR/Cas-9

• Processo: 19/18565-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de novembro de 2019
• Data de Término da vigência: 30 de setembro de 2020
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Imunologia - Imunologia Aplicada
• Pesquisador responsável: Carla Lima da Silva
• Beneficiário: Milena Marcolino de Souza
• Instituição Sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 13/07467-1 - CeTICS - Centro de Toxinas, Imuno-Resposta e Sinalização Celular, AP.CEPID
• Assunto(s): Toxicologia Biologia computacional Hibridização in situ RNA mensageiro Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas CRISPR-Cas9 Thalassophryne nattereri Peixe-zebra
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: aerolisinas | Cas-9 | Crispr | Hibridização in situ | imunidade contra patogenos | Natterina | Zebrafish | Toxinologia

Resumo

A família de proteínas Natterina, encontradas no veneno do peixe Thalassophryne nattereri, possui cinco ortólogos (1 - 4 e -P) com domínios N-terminal (DM9) e C-terminal (aerolisina). Sequências de proteínas Natterin-like podem ser encontradas em diferentes células da defesa imune de variadas espécies de peixes peçonhentos ou não; e ainda, recentes estudos apontam para a participação de proteínas Natterin-like na defesa imune contra patógenos. As proteínas do tipo aerolisina, conhecidas por proteínas formadoras de poros (PFTs), estão presentes em aproximadamente 30% de todas as proteínas/toxinas em bactérias patogênicas e são capazes de ativar o inflamassoma NRLP3. A análise bioinformática de espécimes de zebrafish revela algumas isoformas de aerolisina que compartilham 60% de identidade com as sequências das proteínas Natterin-like de bagre e lampreia, as quais são consideradas moléculas de defesa contra patógenos. O zebrafish tem se mostrado um excelente organismo modelo para a manipulação genética por conta de sua transparência, separação temporal das respostas imunes, fácil e menor custo de manutenção e manipulação, e seu sistema habilita imagens quantitativas de alta resolução, além de possuir 70% de homologia com os genes humanos. Nosso grupo vem testando a hipótese de que as Natterinas agem como moléculas de defesa nos peixes hospedeiros, utilizando o sistema mais eficiente de loss-of-function CRISPR-Cas9 para silenciamento do gene natterin-like. O objetivo deste projeto de iniciação cientifica é validar a eficiência da depleção por CRISPR-Cas9 do gene da natterin-like pela avaliação do mRNA nas larvas de zebrafish silenciadas pela técnica de hibridização in situ. (AU)