Uso de CRISPR/base editors para a geração de células knockin para a mutação TP53 p.R337H, a qual está associada com a Síndrome de Li-Fraumeni

• Processo: 19/27267-3
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de junho de 2020
• Data de Término da vigência: 08 de março de 2021
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Genética - Genética Humana e Médica
• Pesquisador responsável: Martín Roffé
• Beneficiário: Anny Beckmann
• Instituição Sede: A C Camargo Cancer Center. Fundação Antonio Prudente (FAP). São Paulo , SP, Brasil
• Assunto(s): Biologia molecular Síndrome de Li-Fraumeni Linhagem celular Mutação CRISPR-Cas9 Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: base editors | Crispr | Li Fraumeni | R337H | Tp53 | Biologia molecular

Resumo

TP53 (p53) é um supressor tumoral cujas funções e mutações são muito estudadas. Alterações germinativas no gene que a codifica podem levar à síndrome de Li-Fraumeni (LFS), caracterizada clinicamente pelo desenvolvimento de tumores em múltiplos órgãos, aparecendo geralmente numa idade precoce. A mutação que leva à substituição R337H (TP53R337H), que altera o domínio de oligomerização impede a formação de tetrâmeros, função necessária para a correta atividade de TP53. Os poucos trabalhos publicados sobre seu mecanismo descrevem que a função de TP53R337H não era diferente da selvagem quando expressas em linhagens celulares deficientes para a proteína, enquanto outras mutações na mesma região do supressor tumoral (R337C, L344P) eram deletérias para sua função. Foi observado que os estudos das mutações R337H foi utilizada a técnica de transfecção transiente em células nocaute para TP53wt para expressar TP53R337H, gerando células onde a quantidade expressa de proteína mutante poderia ser aberrante em comparação às células dos pacientes com LFS, pudendo mascarar os efeitos reais do mutante. Neste projeto pretendemos definir quais são as alterações moleculares induzidas pela mutação R337H utilizando uma nova variação da técnica de edição genômica CRISPR/Cas9, que permite a edição de bases sem a necessidade de recombinação homóloga, para gerar células knockin contendo a mutação R337H. Com esses mutantes avaliaremos a expressão e estabilidade da TP53R337H, além das interações com outras proteínas (e.g. MDM2) e aspectos relacionados às respostas dependentes de TP53 (ativação por dano ao DNA, indução de parada de ciclo celular e apoptose). Com isso esperamos gerar conhecimentos e técnicas que auxiliem o melhor entendimento e formulação de novos tratamentos para as famílias brasileiras portadoras da mutação.