Validação funcional de poteciais non-coding RNAs diferenciamente expressos durante o ciclo de vida de Leishmania viannia braziliensis

• Processo: 20/00087-2
• Linha de fomento: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Vigência (Início): 01 de outubro de 2020
• Vigência (Término): 30 de setembro de 2022
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Parasitologia - Protozoologia de Parasitos
• Pesquisador responsável: Angela Kaysel Cruz
• Beneficiário: Caroline Ricce Espada
• Instituição-sede: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). Universidade de São Paulo (USP). Ribeirão Preto , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 18/14398-0 - Centro Reino-Unido-Brasil para o Estudo da Leishmaniose (JCPiL), AP.TEM
• Assunto(s): Biologia molecular Leishmania Expressão gênica RNAs não codificadores CRISPR-Cas9 Inativação gênica

Resumo

Durante seu ciclo de vida, o parasita digenético Leishmania coloniza ambientes hostis, com diferentes características fisiológicas, exigindo precisão na modulação da expressão de genes. Sua organização genética com características peculiares, como a falta de promotores canônicos para a RNA polimerase II, a transcrição de genes não relacionados em unidades policistrônicas e o processamento do mRNA maduro por trans-splicing sugere que a regulação da expressão gênica nestes organismos resulta principalmente de modificações pós-transcricionais. Sabe-se que RNAs não codificadores de proteínas (ncRNAs) podem desempenhar um papel fundamental na regulação da expressão gênica em eucariotos. Esses elementos foram identificados no genoma de tripanosomatídeos nos últimos anos e com o avanço das abordagens de bioinformática, novos ncRNAs putativos vêm sendo descritos nestes organismos. O papel funcional desses elementos na regulação da expressão gênica nesses parasitas, no entanto, ainda não foi acessado com propriedade. O laboratório da Dra. Cruz tem buscado entender como se dá a regulação da expressão gênica de Leishmania, com o objetivo em longo prazo de encontrar alvos potenciais para o desenvolvimento de novos medicamentos ou vacinas. Recentemente, 295 ncRNAs foram encontrados pelo grupo como diferencialmente expressos entre os diferentes estágios de vida de L. (V.) braziliensis. Neste projeto, estamos propondo investigar o papel funcional destes ncRNAs. Isto será feito a partir de uma varredura inicial de aproximadamente 50 ncRNAs, os quais serão deletados dos parasitas utilizando a técnica de edição gênica por CRISPR/Cas9. Cada linhagem nocaute gerada carregará uma sequência específica de nucleotídeos (barcode) e serão então submetidas à caracterização fenotípica de crescimento, sobrevivência após jejum e infectividade, a fim de desvendar o papel funcional desses ncRNAs diferencialmente expressos no fitness do parasita. Uma vez que o nocaute de elementos que emergem de regiões não traduzidas (UTRs) pode levar a alterações fenotípicas que resultem de modificação da estabilidade do mRNA ou da taxa de tradução, e não necessariamente causados pelo ncRNA, também estamos propondo desenvolver um sistema de silenciamento de RNA utilizando o sistema CRISPR/Cas13 para tripanosomatídeos. Isso seria uma ferramenta valiosa para caracterizar o papel funcional de ncRNAs emergentes de UTRs, por atuar no nível de RNA, deixando o genoma do parasita inalterado. Nossos resultados ajudarão a entender a regulação da expressão gênica de Leishmania e podem resultar na descoberta de ncRNAs e vias essenciais do parasito, que podem ser direcionados no futuro para descoberta de novos medicamentos ou vacinas. (AU)