Função das nucleases MRE11 e EXO1 e helicase BLM na variação antigenica em Trypanosoma brucei

• Processo: 22/16039-2
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de abril de 2023
• Data de Término da vigência: 31 de março de 2024
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Maria Carolina Quartim Barbosa Elias Sabbaga
• Beneficiário: Ricardo Obonaga Gómez
• Supervisor: Lucy Glover
• Instituição Sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: Institut Pasteur, França
• Vinculado à bolsa: 19/01895-8 - Função das nucleases MRE11, DNA2 e EXO1 na ressecção do DNA terminal e o reparo das quebras de dupla fita em Trypanosoma brucei, BP.PD
• Assunto(s): Reparo do DNA Trypanosoma brucei brucei Variação antigênica
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: antigenic variation | BLM helicase | DNA repair | Double strand break | MRE11 e EXO1 nucleases | Trypanosoma brucei | DSB repair and antigenic variation

Resumo

As quebras de fita dupla de DNA (DSBs) são uma das formas mais tóxicas de danos ao DNA. Estes podem surgir acidentalmente durante o metabolismo celular normal ou após a exposição das células a agentes que danificam o DNA. A falha em repará-los pode resultar em instabilidade genômica, uma característica das células cancerígenas. Em eucariotos, as DSBs são reparadas por recombinação homóloga (HR) e ligação de extremidades não homólogas (NHEJ). Em HR e ligação de extremidades mediada por microhomologia (MMEJ) (um tipo de NHEJ independente do heterodímero Ku), as cadeias de DNA 5' das DSBs são degradadas nucleoliticamente por meio de um processo denominado ressecção de extremidades do DNA. Esse processo, crítico para a escolha da via de reparo por HR ou MMEJ e sinalização de checkpoint, é conduzido pelas nucleases MRE11, DNA2 e EXO1 e gera caudas de DNA de fita simples com terminação 3' com diferentes comprimentos de sequências de homologia. Na maioria dos eucariotos, o reparo por HR e MMEJ é conservado, incluindo Trypanosoma brucei, o parasita responsável pela tripanossomíase humana africana, uma doença fatal se não tratada. Neste parasita, a ressecção do DNA não é bem compreendida. Assim, neste contexto, o presente projeto de pesquisa pretende caracterizar as funções das principais nucleases na ressecção de DNA e reparo de DSBs. Assim, as nucleases MRE11 e EXO1 e helicase BLM de T. brucei serão marcadas com diferentes epítopos usando um sistema de edição alternativo de CRISPR/Cas9 sem marcador de seleção, e logo um ou dois genes serão silenciados em diferentes configurações usando RNA de interferência. Em vez de DNA2, o gene BLM será silenciado, porque não encontramos um candidato confiável para a proteína DNA2 usando ferramentas de alinhamento de sequência. Além disso, a escolha de estudar o BLM se deu porque ele trabalha em conjunto com o DNA2 para ressectar o DNA em leveduras e células de mamíferos. Com esta abordagem, mediremos parâmetros como localização nuclear, ligação ao DNA e níveis de proteínas. A ressecção final do DNA será medida usando qPCR a partir de um único DSB gerado pela atividade da enzima de restrição I-Scel fusionada a um domínio de desestabilização (DD), que será controlado no espaço e no tempo pela estabilização com Shield. Além disso, as funções dessas nucleases no reparo de DSB serão avaliadas usando um sistema repórter que permite a reconstituição de genes de proteínas fluorescentes verde ou vermelha dependendo da longitude da ressecção. Além disso, determinaremos se há diferenças na participação dessas nucleases na ressecção das extremidades do DNA e no reparo de DSBs dependentes do ciclo celular. Com esses resultados, esperamos contribuir com a ampliação do nosso entendimento sobre como ocorrem as primeiras etapas do reparo de DSBs de DNA em T. brucei. (AU)