Aplicação da tecnologia CRISPR/Cas9 na edição gênica de L. amazonensis: produção de nocautes e tagging de enzimas envolvidas no metabolismo de L-arginina.

• Processo: 23/07024-4
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de junho de 2023
• Data de Término da vigência: 30 de novembro de 2023
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Lucile Maria Floeter-Winter
• Beneficiário: Vinícius Yamazaki Gomes
• Instituição Sede: Instituto de Biociências (IB). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 18/23512-0 - A relação Leishmania-hospedeiro sob a ótica das ‘ômicas’, AP.TEM
• Assunto(s): Arginina Edição de RNA
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Arginina | mutante | poliamina | Transportador | Edição Gênica

Resumo

Organismos do gênero Leishmania são parasitas intracelulares obrigatórios de células do sistema fagocítico mononuclear de muitos hospedeiros vertebrados e, sua biologia oferece características ímpares como modelo de estudo na interação patógeno - hospedeiro. Especificamente, a proposta aqui submetida, tem foco no transportador AAP3. A aplicação da tecnologia CRISPR/Cas9 vem sendo empregada nos projetos do Laboratório e tem gerado resultados interessantes na caracterização de alvos do metabolismo de L-arginina em L. amazonensis. A linhagem expressando a endonuclease Cas9 (La-Cas9) está bem estabelecida e vem sendo usada para a geração de mutantes nocautes do transportador de L-arginina amino acid permease 3 (aap3). No entanto, como já apresentado em relatórios anteriores do projeto temático em questão, a sequência codificante desse transportador está presente em duas cópias em tandem, em um cromossomo tetraploide. Essa característica dificulta tecnicamente a obtenção de linhagens nocauteadas e algumas estratégias estão sendo pensadas para contornar as dificuldades impostas.Neste projeto propõe-se obter L. amazonensis mutantes nocautes nulos de AAP3 pela aplicação do protocolo CRISPR/Cas9, com alterações no protocolo inicialmente proposto, de modo a utilizar RNA's guias que direcionam a endonuclease a sequências adjacentes às duas cópias do gene. Entre as mudanças estratégicas, estão a utilização de regiões alternativas como alvos de clivagem, além da obtenção de uma linhagem background que expressa a proteína a ser deletada por meio de um epissomo. Sequências mais confiáveis do que aquelas obtidas nos bancos públicos foram obtidas nesse interim, com o sequenciamento de cosmídeos de biblioteca genômica da linhagem de L. amazonensis utilizada nos nossos estudos. Isso nos permite desenhar os moldes de RNAs guias com mais segurança e investir em novas tentativas de deletar integramente o nosso alvo.