Estudos estruturais das subunidades do complexo da membrana interna do Sistema de Secreção do Tipo IV de Xanthomonas citri por espectroscopia de RMN e criomicroscopia eletrônica

• Processo: 24/03217-5
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de abril de 2024
• Data de Término da vigência: 02 de maio de 2025
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Biofísica - Biofísica Molecular
• Pesquisador responsável: Roberto Kopke Salinas
• Beneficiário: José Edwin Neciosup Quesñay
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 21/10577-0 - Centro de Pesquisa em Biologia de Bactérias e Bacteriófagos (CEPID B3), AP.CEPID
• Assunto(s): Proteínas da membrana Xanthomonas citri
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: bacterial secretion systems | membrane proteins | Structural Biology | Xanthomonas citri | RMN de proteínas

Resumo

Sistemas de Secreção do Tipo IV (T4SS) bacterianos são nanomáquinas que transportam macromoléculas para o meio extracelular ou para uma célula alvo. O T4SS do fitopatógeno Xanthomonas citri (XAC-T4SS) pertence à classe dos T4SS "minimizados", que são formados por 11 subunidades VirB e por VirD4, uma proteína acopladora. Sistemas de secreção do tipo IV expandidos adquiriram subunidades adicionais, provavelmente necessárias para funções específicas. Exemplos de T4SS expandidos são os sistemas DotD/Icm de L. pneumophila, o sistema Cag de H. pylori e o sistema conjugativo Tra codificado pelo plasmídio IncF (T4SSF). O XAC-T4SS é um sistema de translocação de efetores, que secreta toxinas para matar outras bacterias gram-negativas. Todos os T4SS exibem um complexo associado à membrana externa (OMCC), o qual é conectado por uma haste (ou por um canal) ao complexo da membrana interna (IMC). Estudos recentes por modelagem com base em dados de criomicroscopia eletrônica (Cryo-EM) do T4SS completo (sem VirD4 e VirB11) mostraram que o IMC do T4SS conjugativo é formado pelas hélices transmembranares de VirB8 e VirB10, e pelas proteínas transmembranares politópicas VirB3 e VirB6. Além disso, um hexâmero da ATPase VirB4 foi observado na base citoplasmática do IMC. Enquanto a estrutura do OMCC do XAC-T4SS foi resolvida por Cryo-EM, ainda não se isolou e se resolveu as estruturas sdo IMC do XAC-T4SS ou do T4SS completo. Considerando-se que a caracterização estrutural do IMC é uma tarefa bastante difícil, o estudo de subunidades isoladas poderia revelar informações preciosas ao antecipar aspectos estruturais do complexo maior. Neste sentido, o objetivo dessa proposta é desenvolver protocolos para a expressão e purificação de VirB6 e VirB8 do XAC-T4SS, e investigar a interação dessas subunidades com VirB10, VirB2 e VirB5 por métodos biofísicos como RMN e ITC. VirB2 e VirB5 devem fazer parte do pilus do XAC-T4SS. Além disso vamos construir um vetor de expressão codificando para VirB3/VirB4/VirB5/VirB6 e VirB10. A purificação deste subcomplexo poderia fornecer amostras adequadas para caracterização estrutural por constrastação negativa ou Cryo-EM.