Análise da resposta inflamatória das células dTHP-1 tratadas com hidroperóxido de urato.

• Processo: 24/08974-9
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de setembro de 2024
• Data de Término da vigência: 31 de agosto de 2025
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica
• Pesquisador responsável: Flavia Carla Meotti
• Beneficiário: Antônio Paulo Siqueira Pratti
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 18/14898-2 - Processos redox na inflamação e o seu papel sobre doenças inflamatórias, AP.JP2
• Assunto(s): Ácido úrico Hidroperóxido de urato Inflamação NF-kappa B Fator 2 relacionado a NF-E2
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: ácido úrico | hidroperóxido de urato | Inflamação | NF-kB | Nrf2 | redox | Processos redox da inflamação

Resumo

Sendo derivado do produto de degradação das purinas, o ácido úrico vem sendo relacionado com doenças de perfil inflamatório crônico, como a aterosclerose, tendo também o macrófago como uma célula fundamental na gênese dessa doença. Sabe-se que macrófagos são células do sistema imune inato, que respondem a estímulos oxidantes ativando duas principais vias inflamatórias: via do NF-kB e via do Nrf2, sendo o passo inicial de ambas as vias a translocação dos fatores de transcrição NF-kB e Nrf2 para o núcleo. No entanto, pouco se sabe sobre os efeitos causados nessas vias pelo hidroperóxido de urato (HOOU), um oxidante sintetizado no burst oxidativo inflamatório pela enzima mieloperoxidase, a partir do ácido úrico. Assim, o presente trabalho tem como objetivo avaliar a resposta de sinalização de Células Leucêmicas Humanas Monocíticas diferenciadas (dTHP-1) frente ao tratamento com HOOU, comparando os níveis de expressão de NF-kB e Nrf2 nas frações citosólica e nuclear, permitindo, dessa forma, entender melhor o efeito biológico do HOOU frente a um processo inflamatório. Serão realizados tratamentos com LPS, TNF-±, tBHQ, HOOU ou fase móvel (FM) para obtenção de duas frações, uma enriquecida do conteúdo citoplasmático e outra nuclear. Esse enriquecimento será realizado através da lise inicial do citoplasma, seguido da precipitação do núcleo, coleta do sobrenadante e por fim lise do núcleo precipitado. A expressão de NF-kB e Nrf2 será medida em ambas as frações via Western-Blot e a eficácia da separação das frações será determinada pela presença de ²-actina exclusivamente na fração citosólica e de lâmina B1 apenas na fração nuclear, visto que essas proteínas são exclusivas desses compartimentos. Além disso, seguindo os mesmos tratamentos, mas sem a separação das frações, será determinado o efeito do HOOU na produção de IL-1² por ELISA e na expressão de mRNA HO-1 e mRNA IL-1² por RT-PCR. Também será realizada a padronização de uma co-cultura de dTHP-1 e células leucêmicas humanas de origem mielóide diferenciadas (dHL-60), estabelecendo a proporção de ambas as células e o tempo de incubação para a obtenção de uma resposta semelhante a ativação do sistema imune em um meio biológico, utilizando grupos controles sem tratamento, 1 ¼g/mL LPS, 5 ng/mL TNF-± e 20 ¼M tBHQ para determinar as condições ideais. A resposta será determinada através da ativação do promotor presente no plasmídeo NF-kB firefly em células dTHP-1 previamente transfectadas. Após a padronização será feito a incubação das células com 200 ¼M ácido úrico, para induzir a formação de HOOU, e os experimentos serão repetidos.