Análise e comparação da resposta do novo biosensor PxIII-roGFP2 em diferentes ambientes intracelulares

• Processo: 24/16691-7
• Modalidade de apoio: Bolsas no Exterior - Estágio de Pesquisa - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 10 de março de 2025
• Data de Término da vigência: 09 de julho de 2025
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Flavia Carla Meotti
• Beneficiário: Isadora Medeiros
• Supervisor: Jose Pedro Friedmann Angeli
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Instituição Anfitriã: Julius-Maximilians-Universität Würzburg (JMU), Alemanha
• Vinculado à bolsa: 23/08303-4 - Análise da produção de hidroperóxidos orgânicos por células leucêmicas promielocíticas humanas (HL-60) em tempo real através do biossensor PxIII-roGFP2, BP.IC
• Assunto(s): Ferroptose Técnicas biossensoriais
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Ferroptose | Hidroperóxidos orgânicos | roGFP2 | tecnicas biossensoriais

Resumo

Hidroperóxidos lipídicos são marcadores da ferroptose, uma forma de morte celular não apoptótica baseada no desequilíbrio redox causado pela peroxidação de fosfolipídios, produção de hidroperóxidos orgânicos e disfunção do metabolismo do ferro. É essencial compreender a fundo o papel que essas moléculas desempenham em cada estágio dos processos de ferroptose para melhor compreender seu desenvolvimento em diferentes condições clínicas. No entanto, detectar tais moléculas e avaliar o estado redox celular em tempo real permanece um grande desafio. Com base nisso, estamos focados em caracterizar um biossensor recentemente desenvolvido para monitorar a produção de hidroperóxidos orgânicos em células de mamíferos. O biossensor PxIII-roGFP2 foi obtida pelo fusionamento da proteína redox-sensitive Green Fluorescent Protein 2 (roGFP2) à enzima non-selenium glutathione peroxidase (PxIII) de Trypanosoma brucei. Em nossos experimentos anteriores, PxIII-roGFP2 mostrou-se mais específica para reagir com hidroperóxidos orgânicos in vitro e teve uma resposta mais intensa em células transfectadas quando tratadas com essa classe de oxidantes, demonstrando ser uma ferramenta promissora para detectar hidroperóxidos orgânicos produzidos no contexto intracelular. Agora, pretendemos aprofundar essa caracterização por meio da avaliação da resposta do biossensor a oxidantes produzidos internamente. Durante este BEPE, primeiro transfectaremos células HeLa para expressar PxIII-roGFP2 e, em seguida, realizaremos o knockout do gene da glutationa peroxidase 4 (GPx4), que codifica a enzima responsável pela eliminação de peróxidos de fosfolipídios. Em seguida, as células serão tratadas com Erastina, um composto que pode intensificar a peroxidação lipídica ao impedir a síntese intracelular de glutationa e causar disfunção no metabolismo do ferro. Dessa forma, induzindo a ferroptose e criando um ambiente com prevalência de peróxidos de fosfolipídios, poderemos avaliar se o novo biossensor consegue detectar esse tipo de oxidante produzido internamente. Em seguida, transfectaremos e trataremos células knockout para a enzima peroxirredoxina 6 (PRDX6) para avaliar a resposta do biossensor em outro contexto gerador de peróxidos lipídicos, uma vez que essa enzima pode eliminar peróxidos lipídicos por um mecanismo diferente do GPx4. Também analisaremos a PxIII-roGFP2 frente à ferroptose causada exclusivamente pelo tratamento com Erastina. Manipulando esses grupos, poderemos gerar ambientes intracelulares com prevalência de hidroperóxidos orgânicos, que são favoráveis para serem detectados pelo novo biossensor, e comparar seu funcionamento nessas três condições de ferroptose, que possuem diferentes causas. Células HeLa expressando PxIII-roGFP2 também serão tratadas com fator de crescimento epidérmico (EGF) para promover uma produção intracelular de peróxido de hidrogênio (H2O2), criando uma condição onde se espera uma resposta menos intensa ou mais lenta do biossensor. A resposta do biossensor será então medida pela variação de sua fluorescência nos dois diferentes contextos redox (favoráveis à resposta do biossensor, pelo predomínio de hidroperóxidos orgânicos, e outro que não o é, devido predomínio de H2O2) e então comparada. Também realizaremos essas condições em células HeLa transfectadas para expressar o sensor Hyper7, que detecta H2O2 de maneira específica, para ser usado como controle da prevalência de H2O2 (quando tratando com EGF) e da redução de H2O2 (quando induzida a ferroptose). Além disso, com um estágio no Laboratório de José Pedro Friedmann Angeli - um grupo com ampla experiência em manipular, aplicar e analisar condições ferroptóticas - será possível adquirir expertise em trabalhar com peroxidação lipídica e vias de morte celular não apoptótica, que vai além de nossa experiência atual, alcançando um nível ainda mais elevado de produção acadêmica para o nosso Laboratório.