Desenvolvimento de um vírus recombinante da doença de Newcastle capaz de expressar a proteína SaCas9

• Processo: 25/05205-7
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de agosto de 2025
• Data de Término da vigência: 31 de julho de 2026
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Biologia Geral
• Pesquisador responsável: Pedro Luiz Porfirio Xavier
• Beneficiário: Manoela Brito Lopes
• Instituição Sede: Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos (FZEA). Universidade de São Paulo (USP). Pirassununga , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 22/06305-7 - Identificando novos alvos terapêuticos em Adenocarcinoma Ductal de Pâncreas combinando modelos e abordagens relevantes, AP.GR
• Assunto(s): Carcinoma ductal pancreático Proteína 9 associada à CRISPR Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas Vírus da doença de Newcastle Oncologia molecular
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Adenocarcinoma Ductal de Pâncreas | Cas9 | Crispr | Edição genômica | Terapias inovadoras | Vírus da Doença de Newcastle | Virus oncolítico | Oncologia Molecular

Resumo

O vírus da doença de Newcastle (NDV) apresenta um potencial significativo como abordagem terapêutica para o tratamento de neoplasias, devido à sua capacidade natural de infectar e matar seletivamente células cancerosas, já que essas geralmente possuem sistemas antivirais ineficientes. No que diz respeito ao Adenocarcinoma Ductal de Pâncreas (ADP), alguns estudos têm demonstrado o potencial oncolítico do vírus NDV nesse tipo de câncer. Inclusive, no projeto Geração da FAPESP, processo 2022/06305-7, estamos testando o potencial oncolítico do vírus NDV em diferentes modelos de ADP, incluindo modelos tridimensionais (3D) como esferoides e tumoresferas. O complexo de edição gênica constituído por RNA guias e a proteína Cas9, conhecido como CRISPR/Cas9, é uma ferramenta poderosa para o desenvolvimento de abordagens de terapia gênica contra o câncer, sendo capaz de "consertar" genes que estejam mutados. Interessantemente, vírus oncolíticos são reconhecidos como alternativas promissoras para transportar terapias gênicas contra o câncer, incluindo sistemas CRISPR/Cas9. Nesse contexto, um vírus NDV geneticamente modificado capaz de expressar a enzima Cas9 e de transportá-la, seletivamente, para células cancerosas, poderia ser uma poderosa ferramenta terapêutica contra o câncer, incluindo o ADP. No presente projeto de iniciação científica, nós iremos desenvolver um vírus NDV geneticamente modificado, expressando a proteína SaCas9. O projeto tem como principal objetivo determinar qual a melhor proteína Cas a ser expressa pelo vírus NDV, sem comprometer a viabilidade de geração e resgate do vírus NDV. Para isso, um plasmídeo anti-genoma do vírus NDV será clonado com as sequências gênicas codificadoras de SaCas9, junto a uma região promotora forte. O resgate do vírus NDV-Cas9 será realizado por genética reversa, em células BHK-T7/9. Para isso, um coquetel de transfecção vai ser preparado utilizando Lipofectamina 3000, o plasmídeo anti-genoma principal e os plasmídeos auxiliares, contendo os genes NP, P e L do vírus NDV. Após 48 horas, as partículas virais serão coletadas e propagadas em ovos embrionados de 9 dias de desenvolvimento, durante 96 horas. O líquido alantóide dos ovos será coletado e o teste de hemaglutinação de hemácias será utilizado para determinar a presença ou a ausência do vírus. A titulação e determinação do PFU (plaque forming units) do vírus será realizada em células Vero. A fidelidade e a estabilidade do vírus serão realizados pelo sequenciamento do gene F do vírus NDV. A expressão das proteínas SaCas9 serão verificadas por RT-qPCR e Western blot. Dez passagens do vírus serão realizadas em ovos embrionados, afim de observar a estabilidade da expressão das proteínas SaCas9. Assim, essa iniciação científica tem, como principal meta, gerar o vírus NDV expressando as proteínas Cas9, determinando os primeiros passos para o desenvolvimento de um vírus oncolítico capaz de exibir potencial anti-tumoral através de efeitos de oncólise e edição gênica de alvos terapêuticos relevantes, através do sistema NDV-CRISPR/Cas9. (AU)