Otimizacao da clonagem, expressao e purificacao do amblyomin-x, avaliacao do mecanismo de acao na inducao da citotoxicidade em celulas tumorais e na genese de novos vasos em modelos de tumor.

• Processo: 08/54821-7
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Pós-Doutorado
• Data de Início da vigência: 01 de dezembro de 2008
• Data de Término da vigência: 31 de outubro de 2012
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica
• Pesquisador responsável: Ana Marisa Chudzinski-Tavassi
• Beneficiário: Simone Michaela Simons
• Instituição Sede: Instituto Butantan. Secretaria da Saúde (São Paulo - Estado). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 98/14307-9 - Center for Applied Toxinology, AP.CEPID
• Assunto(s): Fermentação Pichia pastoris
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Amblymin-X | Amblyomma Cajennese | Anti-Tumorigenico | Fermentacao | Inibidor De Fator X Ativo | Pichia Pastoris

Resumo

Uma biblioteca de cDNA foi construída com as glândulas salivares do carrapato Amblyomma cajennense (Batista et al.,2008) 1 é a partir dela foi clonado e expresso um inibidor do tipo Kunitz denominado Amblyomin-X. Esta proteína além de inibir o FXa da coagulação também demonstrou citotoxicidade para células tumorais e não interferiu com células endoteliais normais nem tampouco com polímorfonucleares normais, e além disso, apresentou regressão de tumores de melanoma implantados em camundongos (in vivo). Estes estudos geraram uma patente, a qual foi depositada (INPI, PI 0406057-1). O propósito da patente é a utilização terapêutica desta molécula, porém, órgãos regulatórios como a (FDA) preconizam a isenção da cauda histidina em humanos, no entanto, o Amblyomin-X foi inicialmente obtido com cauda de His (E. coli). Dessa forma, foi realizado outro método de expressão utilizando um sistema que além de produzir a molécula recombinante sem cauda de His, também pudesse ser escalonável e reprodutível, para isso foi escolhido o sistema de expressão em Pichia pastoris. Por esta razão, o presente projeto visa dentro das regras de qualidade (BPL) melhorar o sistema de clonagem, expressão, fermentação em bio-reator até 10 L, e a otimização da purificação permitindo a obtenção da proteína para testes pré-clínicos. Além disso, aprofundar os ensaios cinéticos, como avaliar o mecanismo de ação de indução de citotoxicidade em células tumorais e a gênese de novos vasos em tumor de melanoma, pâncreas e rim, utilizando a microscopia intravital. (AU)