Estudos estruturais e bioquímicos de XAC3230, um possível fator de virulência da família NAD:arginina ADP ribosiltransferase do fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv citri

• Processo: 08/00669-0
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Iniciação Científica
• Data de Início da vigência: 01 de abril de 2008
• Data de Término da vigência: 30 de setembro de 2009
• Área de conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Química de Macromoléculas
• Pesquisador responsável: Shaker Chuck Farah
• Beneficiário: Clarissa Ribeiro Reily Rocha
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 05/59243-3 - Análise estrutural e funcional de sistemas multiprotéticos para a patogenicidade de Xanthomonas axonopodis pv. citri, AP.TEM
• Assunto(s): Biologia estrutural Fatores de virulência Toxinas bacterianas Xanthomonas axonopodis Proteínas Cristalografia de proteínas Expressão de proteínas
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Biologia Estrutural | citri | Cristalografia de Proteínas | Fatores de virulência | NAD:Arg ADP ribosiltransferase | toxinas bacterianas | Xanthomonas axonopodis pv | Proteínas

Resumo

Descobrimos recentemente que o genoma de Xac codifica para uma proteína, XAC3230, homólogo ao HopU1, HopO1-1 e HopO1-2, fatores de virulência de Pseudomonas syringae pv. tomato. Estas proteínas pertencem a família de NAD:arginina ADP ribosiltransferase (ART) que modificam covalentemente grupos arginina em proteínas alvo. Muitas toxinas bacterianas possuem esta atividade (ex: toxinas de cholera, de pertussis e de diftéria). HopU1, HopO1-1 e HopO1-2 são secretados pelo sistema de secreção do tipo III (T3SS) de P. syringae e foi recentemente demonstrado que HopU-1 suprime a imunidade do hospedeiro por meio de modifição de proteínas alvos da planta que se ligam a RNA. XAC3230 possui uma alta identidade, na sua porção amimo-terminal, com XAC0011 e XAC0286, fatores de virulência possivelmente secretadas pelo sistema de secreção do tipo III em Xanthomonas. Esta sequência N-terminal é provavelmente necessária para sua secreção pela T3SS. XAC3230 nunca foi caracterizada e não foi identificada como possível fator de virulência de Xanthomonas em estudos anteriores. Até o momento, não há nenhuma estrutura de um fator de virulência da família ART derivada de um fitopatôgeno bacteriana. Este projeto tem como objetivo expressar, purificar, cristalizar e determinar a estrutura da proteína XAC3230. Ensaios enzimáticos com a proteína recombinante purificada também serão executados. Finalmente, será produzida uma cepa de Xac em que o gene xac3230 está nocauteado. Para tanto as seguintes etapas serão realizadas: a) Clonagem e expressão do gene que codifica a proteína de interesse; b) Purificação da proteína para fins de cristalização e verificação da sua atividade; c) Ensaios enzimáticos de atividade NAD:arginina ADP ribosiltransferase; d) Cristalização da proteína purificada; e) Determinacao de sua estrutura tridimensional; f) Obtenção de knockout e subsequente complementação com o gene tipo selvagem e um gene mutante; g) Teste em plantas suceptíveis a infecção pelo fitopatógeno tipo selvagem e mutante. (AU)