Mapeamento dos subsítios de interação entre alfa-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. citri e o substrato.

• Processo: 99/10464-5
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado
• Vigência (Início): 01 de dezembro de 1999
• Vigência (Término): 30 de novembro de 2003
• Área do conhecimento: Ciências Biológicas - Bioquímica - Biologia Molecular
• Pesquisador responsável: Ana Claudia Rasera da Silva
• Beneficiário: Jean Marcel Rodrigues Pinho
• Instituição Sede: Instituto de Química (IQ). Universidade de São Paulo (USP). São Paulo , SP, Brasil
• Vinculado ao auxílio: 95/09307-1 - Estudo das interações entre aminoácidos e ligantes na determinação das propriedades catalíticas das enzimas, AP.JP
• Palavra(s)-Chave do Pesquisador: Alfa-Amilases | Estrutura Tridimensional | Mutacoes Sitio-Dirigidas | Proteinas Quimericas | Subsitios Enzima-Subtrato

Resumo

O projeto visa estudar as interações entre os aminoácidos e ligantes e como essas determinam as características funcionais das enzimas, pelo emprego de técnicas de DNA recombinante e estudos de modelagem de proteínas. Como modelo experimental será utilizado o grupo das alfa-amilases, pois essas enzimas possuem especificidade variável, estruturas cristalinas disponíveis, vários genes clonados e sistemas de expressão heterólogos na forma de proteínas funcionais. Neste trabalho, serão mapeados os subsítios de interação entre alfa-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. citri e o substrato. Para isso, a estrutura dar alfa-amylase será modelada e comparada com outros membros da família que já possuem a estrutura resolvida por difração de raio X. A partir desse modelo serão selecionados resíduos que estiverem na interface com o substrato e estes serão mutados para alanina por intermédio de mutações sítio-dirigidas. O gene de alfa-amilase, inserido no plasmídeo pUC19, será mutado e expresso em E.coli utilizando o vetor pET3a. As proteínas quiméricas serão purificadas e caracterizadas de acordo com seus parâmetros cinéticos (Km, Kcat, pH e temperatura ótimos) e quanto ao tamanho dos produtos de hidrólise, utilizando amido solúvel e oligossacarídeos marcados para determinar a afinidade dos subsítios de interação. (AU)

Publicações acadêmicas

(Referências obtidas automaticamente das Instituições de Ensino e Pesquisa do Estado de São Paulo)

PINHO, Jean Marcel Rodrigues. Mapeamento dos subsítios de α-amilase de Xanthomonas axonopodis pv citri envolvidos na interação com o substrato. 2004. Tese de Doutorado - Universidade de São Paulo (USP). Conjunto das Químicas (IQ e FCF) (CQ/DBDCQ) São Paulo.