Caracterização estrutural e funcional das glutarredoxinas ditiolicas de Saccharomyces cerevisiae

Autor(es)

karen Fulan Discola

• Tipo de documento: Tese de Doutorado
• Imprenta: Campinas, SP.
• Instituição: Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de Biologia
• Data de defesa: 2009-12-08

Membros da banca

Luis Eduardo Soares Netto; Jörg Kobarg; Richard Charles Garratt; Francisco Rafael Martins Laurindo; Maria Cristina Nonato

• Orientador: Luis Eduardo Soares Netto

Resumo

Glutarredoxinas (Grxs) são pequenas oxidorredutases que possuem pelo menos um resíduo de cisteína conservado em seus sítios ativos e têm atividade dissulfeto redutase dependente de tiol. Embora Grxs estejam envolvidas em diversos processos celulares, como enovelamento protéico e proteção contra espécies reativas de oxigênio, poucos substratos biológicos dessas enzimas são conhecidos. Na levedura Saccharomyces cerevisiae, oito Grxs foram identificadas (ScGrx1-8); destas ScGrx1-2 são ditiólicas e possuem o motivo Cys-Pro-Tyr-Cys em seus sítios ativos. Ambas Grxs ditiólicas são citosólicas, embora ScGrx2 também seja encontrada na mitocôndria. Neste trabalho, mostramos que ScGrx2 possui atividade específica como oxidorredutase quinze vezes maior do que ScGrx1, embora estas enzimas compartilhem 64% de identidade e 85% de similaridade de seqüência. A análise cinética bi-substrato mostrou que ScGrx2 possui tanto um menor KM para glutationa quanto um maior turnover que ScGrx1. Com o intuito de compreender melhor estas diferenças bioquímicas, determinamos os valores de pKa da cisteína N-terminal (Cys27) dos sítios ativos destas duas proteínas e demonstramos que estes parâmetros não justificam a diferença de atividade observada. Tentando identificar características estruturais relacionadas a essa diferença de atividade, determinamos as estruturas cristalográficas de ScGrx2 na forma oxidada e do mutante ScGrx2-C30S ligado à glutationa a 2.05 e 1.91 Å de resolução, respectivamente, e comparamos estas estruturas com as estruturas de ScGrx1 descritas por Håkansson & Winther, 2007. As análises estruturais nos permitiram formular a hipótese de que substituições dos resíduos Ser23 e Gln52 de ScGrx1 por Ala23 e Glu52 em ScGrx2 poderiam modificar a capacidade da cisteína C-terminal do sítio ativo de atacar o dissulfeto misto formado entre a cisteína Nterminal e glutationa. Nossa hipótese foi testada através de ensaios enzimáticos com proteínas mutantes. Acreditamos que as diferenças funcionais e estruturais observadas entre ScGrx1 e ScGrx2 possam refletir em variações na especificidade por substratos e indicam que estas enzimas possuem funções biológicas não redundantes em S. cerevisiae. (AU)

• Processo FAPESP: 04/11908-4 - Caracterização funcional e estrutural de glutarredoxinas de Saccharomyces cerevisae
• Beneficiário: Karen Fulan Discola
• Modalidade de apoio: Bolsas no Brasil - Doutorado Direto